胆固醇代谢组学测序筛选肝细胞癌术后复发风险及预后标志物

陈默，朱洪旭，王鲁，许蔚起

复旦大学附属肿瘤医院 肝脏外科，上海 200032

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球范围内最常见的癌症之一，中国HCC的发病率始终处于恶性肿瘤前列，给我国居民生命健康和医药卫生事业带来严重威胁与沉重负担[1-2]。尽管先进的影像学检查的应用极大提高了HCC的检出率，但HCC早期转移、高复发率的特性依然使得影像学检查滞后于疾病进展状态，多数患者确诊时尚无法明确肿瘤进展阶段，缺乏对预后的可靠预测，影响对治疗手段的选择与医疗决策[3-4]。因此，探索与肿瘤生物学行为密切相关且可检测的生物标志物，对于评估HCC肿瘤进展阶段、预测患者预后等具有重要意义。代谢重编程是肿瘤发生发展过程中的必由阶段，是肿瘤生物学行为的重要标志[5]。胆固醇代谢重编程是HCC特征性的代谢重塑模式，被多项研究证实通过参与促HCC肿瘤细胞增殖与侵袭、促肿瘤血管生成、重塑HCC抑制性免疫微环境等方式密切调控HCC肿瘤进展的各个阶段[5-8]，提示胆固醇代谢底物实时代谢水平对于HCC肿瘤状态具有潜在的重要提示价值。通过大规模高通量测序分析，筛选与肿瘤生物学行为及HCC患者生存预后密切相关的差异性代谢底物，可能会发现更可靠和精确的预后指标，从而帮助医师更好地预测HCC患者的预后，制定个体化的治疗方案，并提高患者的生存率。

1 资料和方法

1.1 一般资料

对2020年2月1日至2020年3月31日在复旦大学附属肿瘤医院行手术治疗的46例HCC患者手术病理留取的肝癌组织与癌旁组织进行回顾性研究，患者年龄19～75岁，均经手术病理学检查确诊HCC，临床资料及随访资料完整。

1.2 检测方法

1.2.1 代谢物提取（1）取样本100 mg于2 mL管中，加入750 μL氯仿甲醇混合溶液（2∶1，-20 ℃），涡旋振荡30 s；（2）放入2颗钢珠，放入组织研磨器中，55 Hz研磨90 s；（3）冰上放置40 min，加入190 μLH2O，涡旋振荡30 s，冰上静置10 min；（4）12 000 r/min室温离心5 min，取下层液300 μL，转移至2 mL离心管中；（5）再加入500 μL氯仿甲醇混合溶液（2∶1，-20 ℃），涡旋振荡30 s；（6）12 000 r/min室温离心5 min，取下层液400 μL，转移至2 mL离心管中，样品用真空离心浓缩仪浓缩；（7）用200 μL异丙醇溶解样品，0.22 μm膜过滤，得到待测样本，进行液相色谱-质谱（LC-MS）上机检测。

1.2.2 色谱分析 仪器采用ThermoVanquish，使用ACQUITYUPLC®BEHC 181.7 μm（2.1 mm×100 mm）色谱柱，自动进样器温度设为8 ℃，以0.25 mL/min的流速、50 ℃的柱温、进样2 μL进行梯度洗脱，流动相为乙腈∶水=60∶40（0.1%甲酸+10 mmol/L甲酸铵）（A2）-异丙醇∶乙腈=90∶10（0.1%甲酸+10 mmol/L甲酸铵）（B2）。梯度洗脱程序为0～5 min，70%～57% A2；5～5.1 min，57%～50% A2；5.1～14 min，50%～30% A2；14～14.1 min，30% A2；14.1～21 min，30%～1% A2；21～24 min，1% A2；24～24.1 min，1%～70% A2；24.1～28 min，70% A2。

1.2.3 质谱分析 仪器使用Thermo Q Exactive，电喷雾离子源（ESI），正负离子电离模式；正离子喷雾电压为3.5 kV，负离子喷雾电压为2.5 kV，鞘气30 arb，辅助气10 arb。毛细管温度325 ℃，以分辨率35 000进行全扫描，扫描范围150～2 000，并采用HCD进行二级裂解，碰撞电压为30 eV，同时采用动态排除去除无必要的MS/MS信息。

1.3 统计学分析

本研究对于胆固醇代谢组学测序分析均基于R语言，工作平台为R-studio，肝癌组织与癌旁组织胆固醇代谢底物浓度差异性分析采用配对t检验，组间底物浓度聚类分析通过pheatmap包完成。无进展生存期（progression free survival，PFS）及总体生存期（overall survival，OS）分析采用Kaplan-Meier生存分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC癌组织内差异性上调胆固醇代谢物筛选

本研究共纳入46例符合标准的HCC患者，性别比例为男∶女=37∶9，年龄大于60岁的老年患者27例，BMI≥22.6 kg/m2的超重患者7例；根据术后病理结果，低分化肿瘤（M 0～2）30例，发生微血管侵犯（microvascular invasion，MVI）28例。通过对比肝癌组织与癌旁组织胆固醇代谢通路各代谢物水平，共筛选出含量在肝癌组织中显著上调（P＜0.05）的胆固醇通路代谢物12个，分别为ChE（36:6）、ChE（26:1）、ChE（32:5）、ChE（24:0）、ChE（24:1）、ChE（26:2）、ChE（36:3）、ChE（34:5）、ChE（26:3）、ChE（22:0）、ChE（30:4）、ChE（28:5），均属于胆固醇酯类（图1、表1）。

表1 HCC瘤内差异性上调胆固醇代谢物定量水平

图1 HCC病例肝癌组织与癌旁组织对比差异性胆固醇代谢物筛选

2.2 基于组织病理学风险因素对差异性胆固醇代谢物的聚类分析

为了进一步探索与肿瘤生物学行为密切关联的胆固醇代谢标志物，发现对肿瘤恶性程度和预后预期有重要价值的代谢指标，我们根据病例术后病理结果，以肿瘤分化程度及MVI两个评价肿瘤生物学行为和提示肿瘤复发风险的重要指标为分组依据，将46例HCC病例分别分为低分化组（未分化、1～2级）和高分化组（3～4级）、有MVI组和无MVI组，对各组肝癌组织与癌旁组织胆固醇代谢底物差异性表达水平进行聚类分析，结果提示肿瘤分化程度与是否发生MVI的HCC瘤内特定胆固醇代谢物浓度存在差异性聚类的倾向（图2、图3）。

图2 基于MVI分组的胆固醇代谢物浓度差异性聚类分析

图3 基于肿瘤分化程度分组的胆固醇代谢物浓度差异性聚类分析

2.3 结合组织病理学分级对HCC胆固醇代谢标志物的筛选

为了进一步明确HCC瘤内特异性上调的胆固醇代谢通路底物与肿瘤生物学行为的联系，我们横向对比了上述12个胆固醇酯类底物在高/低分化组与有/无MVI组的浓度差异，结果提示，胆固醇酯类代谢物ChE（32:5）在低分化肝癌组织、有MVI的肝癌组织均表现出有统计学意义的差异性上调，提示其代谢活动与HCC肿瘤生物学行为密切相关（图4）。

图4 基于MVI（A）和肿瘤分化分级（B）分组对肝癌组织中差异性胆固醇代谢物的定量分析

2.4 胆固醇代谢标志物ChE（32:5）对HCC复发与生存预后的提示意义

为了探索ChE（32:5）在与HCC恶性程度相关的同时，是否具有提示HCC患者预后的潜在价值，我们将ChE（32:5）在肝癌组织中显著高于癌旁组织的病例作为高胆固醇组（n=25），ChE（32:5）在肝癌组织与癌旁组织差异无统计学意义的病例作为低胆固醇组（n=21），并分别将肿瘤复发与生存结局作为结局事件，对比两组患者PFS和OS，结果提示高胆固醇组中位PFS（6个月vs12个月，P=0.041）与中位OS（14 个月vs16 个月，P=0.049）均低于低胆固醇组，证实肝癌组织中ChE（32:5）水平作为肿瘤复发及患者总体生存预后指标的重要价值（图5）。

图5 基于ChE（32:5）水平对HCC无复发生存率（A）及总体生存率（B）的生存曲线

3 讨论

作为调节脂质代谢稳态的重要器官，肝脏胆固醇代谢的失调被认为是HCC肿瘤发生发展的驱动因素，与胆固醇调节失常相关的基础疾病（包括肥胖症、糖尿病等）也被普遍认为是HCC的风险因素[9]。胆固醇对于维持细胞膜的完整性和流动性显得更为重要，对于具有高度增殖性质的癌细胞而言是必需的。多项研究表明血清及瘤内胆固醇通过重塑HCC抑制性免疫微环境、加剧效应免疫细胞线粒体损伤、促进氧化应激、刺激肿瘤细胞活性等多方面影响HCC肿瘤生物学进展[10-12]。基于多项临床队列的荟萃分析显示他汀类药物（降脂药）的使用在中西方人群中均与HCC的风险降低显著相关[13]，提示胆固醇与HCC肿瘤发生发展的密切联系。

胆固醇酯是胞内及血浆游离胆固醇在脂酰辅酶A胆固醇脂酰转移酶和卵磷脂胆固醇脂酰转移酶催化下与脂肪酸的结合产物，在HCC发展过程中，脂肪酸是调节代谢的信号前体，同时也是肿瘤细胞侵入和血管生成的能量来源，影响脂肪酸水平胆固醇酯作为胆固醇代谢底物影响HCC进展的重要途径[14]。清华大学陈立功团队[15]报道了替代性激活胆固醇合成通路促进脂肪酸剥夺小鼠HCC肿瘤持续进展的机制研究，武汉大学李友军团队[16]则报道了P53基因缺失通过调节胆固醇酯化，影响胆固醇酯合成从而促HCC恶化进展的相关研究，提示胆固醇酯代谢水平广泛参与调节HCC肿瘤生物学行为，具有提示肿瘤进展级别与恶性程度的潜在价值。

MVI指微静脉内有成团的癌细胞且周围有明确的内皮细胞环绕，具体程度评估分为三个级别：（1）M0，未发现MVI；（2）M1，近癌旁肝组织中出现且不超过5个MVI；（3）M2，近癌旁肝组织中出现至少6 个MVI。MVI的发生常见于HCC病例，是不良预后的风险因素，也是被广泛认为的HCC术后复发的高危因素之一[17]。MVI的病理学评估不仅应用于肝移植手术指征判断、肝切除手术方式选择、肿瘤R0切除范围判定，还是术后辅助治疗与综合治疗决策的重要证据[18]。但MVI评估必须基于完整手术切除标本，同时需要依靠高水平的病理诊断协作，因此探索与MVI发生显著相关且简便易检测的代谢标志物，一方面可以为MVI的病理学评估提供有价值的辅助参考，同时为HCC患者复发与最终预后、手术干预与综合治疗决策提供潜在的预测标志物。

ChE（32:5）是含32 个碳原子的胆固醇酯（分子量为856.7），既往国内外尚无相关研究证实其与HCC肿瘤生物学及临床预后的相关性报道。本研究基于对HCC病例的肿瘤组织标本胆固醇组代谢底物检测分析，筛选出ChE（32:5）在低分化与发生MVI的HCC肿瘤组织内显著上调，并验证了ChE（32:5）表达水平对HCC肿瘤复发与总体预后的预测价值，提示其作为简易可得的临床指标，具有较好的实用性、推广性和临床诊断价值。