吴茱萸凝胶贴膏的质量标准研究*

冯金鹰，卢立欣，纪康康，冉令超

（山东省立第三医院，山东 济南 250031）

小儿口腔溃疡临床治疗比较棘手，难治且易复发，且患儿对口腔外用药物不能很好配合[1]。我院应用由吴茱萸、胆南星和大蒜提取物组成的方剂贴敷涌泉穴取得了良好的临床疗效。吴茱萸[2]，性味辛、苦、温，具有辛苦能降、引热下行的作用；胆南星，味亦辛、苦，可清化热痰；大蒜素具有抗菌消炎、改善局部微循环的作用。三药合用贴敷穴位可起到引火归元、引火下行的作用。临床应用此方剂贴敷涌泉穴治疗小儿口腔溃疡效果显著，但临床应用时需将各药物粉碎，以食醋调成糊状贴敷，使用不便，易污染衣物。本课题组将此方开发为与皮肤生物相容性好、透气、耐汗的凝胶贴膏[3-4]，使用方便且干净卫生。为保证吴茱萸凝胶贴膏的疗效，有效控制其质量，本研究对处方中吴茱萸采用薄层色谱（TCL）法进行定性鉴别，采用高效液相色谱（HPLC）法测定吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量，以期为吴茱萸凝胶贴膏的质量控制提供依据。

1 材料

1.1 主要仪器 Agilent1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；KQ5200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；MS105DU型十万分之一电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）

1.2 药品与试剂 吴茱萸碱（批号：110802-201710）、吴茱萸次碱（批号：110801-202109）均购自中国食品药品检定研究院。吴茱萸药材（批号：20102211）购自安国市一方药业有限公司。吴茱萸凝胶贴膏均为我院药学部自制。乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

前期研究确定的凝胶贴膏制备工艺为：将卡波姆加甘油研磨再加水和三乙醇胺，使其充分溶胀作为A相；明胶加纯化水溶胀作为B相；在研钵中依次加入甘氨酸铝、聚丙烯酸钠NP-700、柠檬酸与高岭土，再加入甘油混匀，将吴茱萸、胆南星微粉和大蒜提取物按等份加入，搅拌均匀作为C相。在60 ℃条件下将A相与B相混匀，再加入C相，混匀，涂布，静置，晾干。按确定的制备工艺制备吴茱萸凝胶贴膏。

2.1 TLC鉴别 取吴茱萸凝胶贴膏1贴，加乙醇60 mL，静置30 min，超声处理30 min，滤过，取滤液作为供试品溶液。取吴茱萸粉末0.4 g，加乙醇10 mL，静置30 min，超声处理30 min，滤过，取滤液作为对照药材溶液。另取吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品，加乙醇分别制成每1 mL含1.5 mg和0.2 mg的溶液，作为对照品溶液。取缺吴茱萸的凝胶贴膏阴性样品，同供试品溶液的制法制成阴性对照品溶液。按照2020年版《中华人民共和国药典》（四部）通则0502[5]薄层色谱法试验，吸取上述3种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯-三乙胺（7.0∶3.0∶0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。（见图1）。

图1 吴茱萸的鉴别

2.2 含量测定[6]

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取吴茱萸碱标准品3.92 mg和吴茱萸次碱标准品2.58 mg，混合，加甲醇25 mL，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品凝胶贴膏1贴（14.5 g），刮下膏体，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，浸泡1 h，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）40 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照品溶液制备 按吴茱萸凝胶贴膏处方工艺制备缺吴茱萸的阴性对照品，并按供试品溶液制备方法制成缺吴茱萸的阴性对照品溶液。

2.2.4 色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS-3色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：28 ℃；流动相：乙腈-水（53∶47）；流速：1 mL/min；检测波长：215 nm；进样量：20 μL。

2.2.5 系统适用性试验 分别精密吸取上述混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液各20 μL，按“2.2.4”项下色谱条件进样测定。结果，样品中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的色谱峰与其相邻色谱峰的分离度均＞1.5，理论板数以吴茱萸碱计不低于3000，色谱图见图2。

图2 HPLC 色谱图

2.2.6 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项下的对照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取各浓度的对照品溶液20 μL，以对照品峰面积对溶液进样量进行线性回归，得到吴茱萸碱的回归方程为y=8167x+150，r=0.9995；吴茱萸次碱的回归方程为y=6016.00x+84.13，r=0.9990。结果表明吴茱萸碱在0.3136～1.8816 μg范围内线性关系良好，吴茱萸次碱在0.2064～1.2384 μg范围内线性关系良好。

2.2.7 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下的混合对照品溶液5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取20 μL，按“2.2.4”项下色谱条件连续进样测定6次，测定峰面积，求得RSD值。

结果测得吴茱萸碱和吴茱萸次碱峰面积的RSD值分别为0.17%和0.31%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 取本品凝胶贴膏1贴，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，放置0、2、4、6、8、10、12、24 h后，按“2.2.4”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。

结果测得吴茱萸碱和吴茱萸次碱峰面积的RSD分别为0.50%和1.10%（n=8），表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.9 重复性试验 取同一批（批号：20220301）凝胶贴膏样品共6份，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.4”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。

试验结果表明吴茱萸碱和吴茱萸次碱总量的相对标准偏差为2.19%，该方法重复性良好。

2.2.10 加样回收率试验 采用加样回收法。称取已知吴茱萸碱、吴茱萸次碱含量的同一批号的样品1 g共6份，分别置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，精密称定。分别精密加入吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.4”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量，按下式计算加样回收率。

加样回收率（%）=（实测值-样品所含被测成分量）/加入对照品量×100%。

结果显示，吴茱萸碱和吴茱萸次碱的平均加样回收率分别为100.20%和100.85%，RSD值分别为2.05%和2.16%（n=6），表明本方法准确度较好。

2.2.11 含量测定 取3批不同批号的吴茱萸凝胶贴膏各1贴（14.5 g），刮下膏体，精密称定，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，各3份，然后按“2.2.4”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量。结果显示3批样品中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的总量分别是1.110 mg/贴、1.119 mg/贴、1.105 mg/贴，平均含量为1.111 mg/贴，RSD值为0.64%。（见表1）

表1 样品含量测定结果

2.3 制剂通则检查 参照2020年版《中华人民共和国药典》（四部）通则0122[5]贴膏剂项下的要求对吴茱萸凝胶贴膏进行检查。

2.3.1 含膏量 取吴茱萸凝胶贴膏1贴，除去盖衬，精密称定，置烧杯中，加适量水，加热煮沸至背衬与膏体分离后，将背衬取出，用水洗涤至背衬无残留膏体，晾干，在105 ℃干燥30 min，移至干燥器中，冷却30 min，精密称定，减失质量即为膏重，按标示面积换算成每100 cm2含膏量，测定结果含膏量为14.50 g。

2.3.2 赋形性 取吴茱萸凝胶贴膏供试品1贴，置37 ℃、相对湿度64%的恒温恒湿箱中30 min，取出，用夹子将供试品固定在一平整钢板上，钢板与水平面的倾斜角为60°，放置24 h，结果膏面无流淌现象。

2.3.3 黏附力 取吴茱萸凝胶贴膏3贴，在18～25 ℃、相对湿度40%～70%条件下放置2 h，分别将供试品背衬用双面胶带固定在倾斜板上，其中供试品上端应位于倾斜板的水平线下线位置，黏性面向上且沿斜面方向的实验长度不超过5 cm，供试品应平整地贴合在板上。将各品种项下规定的钢球放在水平线上线位置上，自斜面自由落下。在3个供试品各自粘住的钢球中，如果3个均为最大钢球球号，或者2个为最大钢球球号，另一个钢球球号仅小一号，为符合规定；如果一个为最大钢球球号，另两个钢球球号仅小一号，则应另取3贴复试，3贴均能黏住最大球号钢球为符合规定。测定结果为3贴吴茱萸凝胶贴膏均能粘住最大钢球球号。

3 讨论

吴茱萸凝胶贴膏贴敷涌泉穴治疗小儿口腔溃疡，发挥作用的主要药物是吴茱萸[7-9]。吴茱萸为芸香科植物吴茱萸或疏毛吴茱萸的干燥将成熟果实，始载于《神农本草经》。吴茱萸在《神农本草经》中被列为中品，味辛、苦，性热，归肝、脾、胃、肾经，功效散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻。其在中医外治法中应用较广，不仅用于寒证，也用于热证。涌泉穴位于足心，为外治法常用穴位。吴茱萸贴敷涌泉穴常用于治疗高血压、失眠等，尤其治疗口腔溃疡效果较佳，并且副作用小[10]。本方中的另外两种药物即胆南星和大蒜提取物起辅助治疗作用，因此本研究选取了吴茱萸作为质量控制的药物。

本研究参考《中华人民共和国药典》（2020年版）吴茱萸的TLC鉴别方法[11]，建立吴茱萸凝胶贴膏中吴茱萸的TLC鉴别方法。结果显示，TLC定性鉴别中检出吴茱萸,且斑点清晰,分离度好,阴性对照品无干扰。分析结果说明吴茱萸碱和吴茱萸次碱斑点清晰、分离良好，阴性对照品无干扰，可作为吴茱萸凝胶贴膏中吴茱萸的专属性鉴别。

吴茱萸含有多种化学成分，包括生物碱、柠檬苦素、萜类、黄酮等，其中生物碱为其主要有效成分。吴茱萸碱具有强心、舒张血管、松弛胃肠平滑肌等药理作用；吴茱萸次碱的作用主要有抗心律失常，对血压的双向调节，以及舒张血管，增加皮肤血流量，降低缺血性脑损伤等作用[12]。《中华人民共和国药典》（2020年版）采用测定吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量控制吴茱萸药材质量，因此本次研究对吴茱萸的主要活性成分吴茱萸碱和吴茱萸次碱进行含量测定，并参考《中华人民共和国药典》（2020年版）吴茱萸的HPLC法[11]，供试品溶液的制备采用70%乙醇提取。试验时发现用该溶剂提取难以滤过。改用甲醇提取易滤过，故本研究采用甲醇提取。本研究采用2020年版《中华人民共和国药典》吴茱萸含量测定项下的流动相[乙腈-四氢呋喃（25∶15）]-0.02%磷酸溶液（35∶65），未获得相应峰。本研究参考相关文献[13-16]，采用乙腈-水（53∶47）为流动相。结果显示吴茱萸碱和吴茱萸次碱分离良好，且基线平稳，因此本研究选择乙腈-水（53∶47）作为流动相。吴茱萸碱在0.3136～1.8816 μg范围内线性关系良好，吴茱萸次碱在0.2064～1.2384 μg范围内线性关系良好；精密度、稳定性、重复性试验的RSD值均小于3.0%；平均加样回收率分别为100.20%、100.85%，RSD值分别为2.05%、2.16%（n=6）。

本研究所建立的质量标准方法准确、可靠，可用于吴茱萸凝胶贴膏的质量控制。