多囊卵巢综合征患者卵泡液代谢组学的研究进展

余佳月，尹太郎，杨菁

(武汉大学人民医院生殖医学中心,湖北省辅助生殖与胚胎发育医学临床研究中心,武汉 430060)

多囊卵巢综合征(PCOS)是一种女性常见的内分泌疾病,流行病学调查显示育龄期女性发病率为5%～18%[1]。临床上主要表现为月经失调、不孕、肥胖、多毛、痤疮,远期可能发生糖尿病、心血管疾病、子宫内膜癌等,但其发病机制和分子基础仍不明确,可能与遗传因素、环境因素、生活方式等有关[2]。目前PCOS治疗以干预生活方式、改善胰岛素抵抗(IR)、调节月经周期等为主,对于育龄期有生育需求的PCOS女性可使用促排卵药物或采用辅助生殖技术(ART)等,但目前治疗效果尚不理想,且接受ART的患者可能会出现卵母细胞质量下降、卵巢过度刺激综合征以及卵泡液代谢模式改变等问题。PCOS患者妊娠结局表现为MⅡ期卵母细胞数、卵裂率、受精率、囊胚转化率降低,而流产率增加[3-4]。卵泡液是卵母细胞生长、卵泡成熟和生殖细胞与体细胞相互联系需要的复杂微环境,卵泡液中代谢物的改变会影响卵母细胞质量及胚胎发育。代谢组学是“组学”领域中的一个相对较新的子领域,它主要研究的是小分子代谢物的种类和浓度。近年来,代谢组学已被应用于PCOS的诊断和治疗,为PCOS的发病机制和生物标志物的识别提供了新见解。本文就PCOS患者卵泡液代谢组学的研究进展做一综述。

一、卵泡液概述

卵泡液主要来自于颗粒细胞、膜细胞、卵母细胞产生的分泌物和通过鞘膜毛细血管转移的血浆成分,由蛋白质、类固醇和多糖组成,是卵母细胞的生长、成熟和排出必不可少的微环境。研究表明,卵泡液中蛋白质、甘油磷脂类和microRNA的水平与卵母细胞质量和妊娠结局有关[5-7]。PCOS患者缺乏高质量成熟卵母细胞可能是由于异常卵泡液代谢物和卵巢局部自分泌旁分泌调控机制所引起。与其他生物样本相比,卵泡液的某些生化特征更容易影响卵母细胞质量和胚胎发育。由于卵泡液是在取卵过程中收集的,所以可以作为一种非侵入性基质,已成为研究PCOS的重要信息来源。

二、PCOS患者代谢组学特征

代谢组学是指用高通量检测方法对特定条件和时间下所有小分子代谢物进行定性定量分析,从而发现生物体对内外环境变化做出的相应应答以及产生的整体代谢改变。与其他组学相比,代谢组学能更加真实地反映生物系统正在发生的事件。PCOS是一种复杂和多系统的代谢性疾病,PCOS患者临床上除有月经稀发、排卵功能障碍外,还常伴有其他代谢异常表现,如高雄激素血症、胰岛素抵抗、血脂异常、糖代谢异常等[8]。目前已将代谢组学技术应用于PCOS研究中,发现PCOS患者存在多条代谢途径紊乱,如脂质、氨基酸、碳水化合物、嘌呤代谢等。代谢组学研究表明PCOS患者通常有糖酵解途径增强、脂质代谢上调、特定氨基酸水平升高等改变,这些小分子代谢物的改变均会影响PCOS患者病情进展。通过核磁共振(NMR)、液相色谱-质谱(LC-MS)和气相色谱-质谱(GC-MS)等技术检测各类生物样本代谢物,了解PCOS疾病状态和发现新的生物标记物以便优化患者的妊娠结局。

三、PCOS患者卵泡液代谢物研究进展概述

(一)葡萄糖

葡萄糖为卵母细胞的成熟、受精及胚胎发育过程提供能量,PCOS患者的代谢紊乱会引起卵泡液中葡萄糖水平的变化。PCOS患者卵巢糖代谢特点表现为卵母细胞的葡萄糖消耗和摄取降低、卵泡液糖酵解途径增强、颗粒细胞内葡萄糖代谢减弱。

卵丘细胞和卵母细胞共同参与葡萄糖的有氧氧化,此过程产生的能量在卵泡生长发育过程中必不可少,而PCOS患者由于葡萄糖转运蛋白(GLUT)向颗粒细胞转位受阻导致葡萄糖利用率降低[9]。Castiglione等[10]使用NMR波谱在PCOS患者卵泡液中检测到葡萄糖含量增加,葡萄糖浓度与受精率和卵裂率呈负相关。Zhao等[11]研究发现PCOS患者卵泡液中丙酮酸、琥珀酸、草酰乙酸、苹果酸水平增高,乳酸和顺式乌头酸水平降低,其中琥珀酸增加使卵丘细胞中线粒体生成减少和炎症反应增强,最终导致卵母细胞生长发育受损。

糖酵解及其产物在卵母细胞发育中发挥重要作用。乳酸是糖无氧酵解途径的终产物,由丙酮酸转化而成,二者关系密切。卵母细胞发育、受精以及着床过程需要大量能量,而PCOS患者由于GLUT表达异常和转位受阻影响葡萄糖利用,因此提供给卵母细胞的能量主要来源于乳酸和丙酮酸[10]。在典型PCOS患者卵泡液中,糖酵解产物乳酸含量显著降低。Zhang等[12]发现丙酮酸在PCOS患者卵泡液中含量显著下降,而其他研究得到了相反的结果[13]。PCOS患者还存在卵丘细胞线粒体功能障碍、氧化还原电位失衡和氧化应激增加,这些变化会阻碍线粒体新陈代谢,并增强糖酵解来补偿能量供应。在体外培养猪卵母细胞过程中,丙酮酸通过促进人类合子基因组激活(ZGA)和降低氧化应激水平来影响早期胚胎发育[14]。PCOS患者有丙酮酸含量降低和高氧化应激水平,因此PCOS患者中的丙酮酸是否通过ZGA影响胚胎发育值得关注。目前PCOS糖代谢中的代谢物表现不一,糖代谢紊乱会对卵母细胞成熟和胚胎发育产生不良影响,但具体机制尚不明确,还需进一步研究。

(二)脂类

1.脂肪酸类:PCOS患者糖利用下降,脂质代谢代偿性上调,卵泡液中脂质代谢物改变会影响卵母细胞成熟以及后续胚胎生长发育[15-16]。脂肪酸类代谢物种类众多,其中包括游离脂肪酸(FAA)、硬脂酸、油酸、棕榈酸、花生四烯酸等。Ding等[16]研究发现与正常女性组相比,PCOS患者中肥胖组、胰岛素抵抗(IR)组和高雄激素血症(HA)组的总FAA水平均显著升高,其中FAA(14∶1)水平升高会损害卵泡发育和卵母细胞成熟,从而影响优质胚胎率。油酸和硬脂酸浓度也与卵母细胞发育能力有关,这可能是PCOS女性妊娠率降低的原因。Feng等[15]发现非肥胖PCOS女性的硬脂酸水平降低;而其他研究显示,PCOS患者硬脂酸水平上调[9,17-18]。PCOS患者卵泡液中油酸水平显著增加,且油酸与胚胎碎片指数呈正相关[9,17]。油酸通过激活ERK1/2信号通路和抑制AMPK信号通路,诱导卵巢颗粒细胞产生炎症反应,这可能是PCOS的发生机制[17]。多项研究发现PCOS患者卵泡液中棕榈酸水平上升,伴有IR的PCOS患者卵泡液中的棕榈酸和十五烷酸含量高于非胰岛素抵抗(NIR)的PCOS患者[9,17-18]。Kobayashi等[19]用动物实验证明在PCOS发展过程中,棕榈酸通过ROS/p38和JNK信号通路诱导细胞色素P17A1和PAI-1基因表达上调以及雄激素生成途径参与卵泡膜细胞自噬过程。花生四烯酸及其衍生代谢物在生育能力和病理妊娠过程中均发挥着重要作用[20-21]。有研究表明,PCOS患者卵泡液中花生四烯酸含量显著增加,IR和HA通过环氧合酶-2(COX-2)途径促进花生四烯酸代谢[17,22]。前列腺素(PG)作为花生四烯酸的衍生代谢物在女性生育能力中起着关键作用[15,22-23]。PCOS患者卵泡液中前列腺素E2(PGE2)、前列腺素F2α(PGF2α)、前列腺素J2(PGJ2)、前列腺素D2(PGD2)和血栓素B2(TXB2)显著高于正常女性(P<0.05),其中PGE2、PGF2α、PGJ2和TXB2与获卵数、MⅡ期卵母细胞数、双原核卵母细胞数呈正相关,PGE2和PGJ2与优质胚胎率呈负相关[15]。Gongadashetti等[23]发现PCOS流产患者卵泡液中8-异构前列腺素(8-IP)显著升高(P<0.05),8-IP可以作为PCOS妇女妊娠丢失的重要标志物。

除以上脂肪酸外,在PCOS患者卵泡液中还发现了其他类别脂肪酸异常。研究表明伴有IR的PCOS患者卵泡液中芥子酸含量降低,说明IR会影响PCOS患者脂质代谢[18]。Castiglione等[10]基于NMR发现β-羟基丁酸水平显著降低。而另一项研究发现PCOS患者卵泡液中乙酰乙酸和β-羟基丁酸水平升高,且两种代谢物与受精率呈正相关[12]。

2.甘油磷脂类:甘油磷脂是细胞膜主要成分和重要的信号分子,PCOS患者卵泡液中一系列甘油磷脂类均发生了显著变化[4,16,24]。Ban等[4]发现正常体重PCOS患者卵泡液中尽管不同结构式的磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇(PI)含量增高,但总PE和总PI水平没有显著差异。Liu等[24]发现PCOS患者磷脂酰胆碱(PC)水平显著降低,卵泡液中PC含量与LH/FSH比值呈正相关,人卵丘细胞中PC含量与LH有关,这意味着PC可能通过LH影响卵母细胞发育。Ding等[16]研究表明PCOS患者卵泡液中溶血磷脂酰甘油(LPG)下降,其中LPG(18∶0)含量与优质胚胎率呈正相关。与对照组相比,PCOS患者的溶血磷脂酸(LPA)显著降低,其中LPA[18∶1(9Z)/0∶0]是预测PCOS患者活产率和分娩率的良好指标[6,24]。LPA可通过激活ERK1/2通路改善未成熟卵母细胞体外成熟(IVM)中的卵母细胞质量[25]。

3.鞘脂类:鞘脂及其代谢产物是一类重要的信号分子,通过调节能量代谢、细胞增殖、细胞凋亡和类固醇激素合成来维持卵泡和卵母细胞生长发育[24,26]。神经酰胺(Cer)是通过鞘磷脂水解或更复杂的鞘脂代谢生成的。有研究发现Cer在PCOS患者卵泡液中增加,其中伴有IR和肥胖PCOS患者的Cer水平显著高于正常女性(P<0.05),而在伴有HA的PCOS女性中没有统计学差异,表明Cer与肥胖和IR有关,而不受睾酮影响,此研究还发现Cer(36∶1)、Cer(38∶1)、Cer(38∶2)、Cer(40∶2)均与优质胚胎率呈负相关[16]。其他研究也表明在PCOS患者体外受精(IVF)过程中,鞘脂代谢和鞘磷脂生物合成异常与双原核(2PN)受精率密切相关,并认为鞘脂通过影响促性腺激素分泌来改变卵母细胞的发育潜力[24]。

4.固醇脂类:类固醇主要包括固醇类、胆汁酸和类固醇激素等,不同的类固醇有不同的作用,卵泡液中类固醇在调节卵泡生成和卵母细胞成熟方面起着至关重要的作用[3,27]。Chen等[28]发现PCOS女性卵泡液中7β-羟基胆固醇(7β-OHCH)含量降低。7β-OHCH水平异常可诱发氧化应激和脂肪酸代谢功能障碍,从而影响卵母细胞生长[29]。Yang等[30]研究发现在PCOS患者卵泡液中,甘胆酸(GC3A)、牛磺胆酸(TCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)和鹅去氧胆酸-3-β-d-葡萄糖醛(CDCA-3Gln)水平上升,并发现GCDCA与FSH和LH呈正相关,CDCA-3Gln的水平也随着窦卵泡计数的增加而上升,表明胆汁酸代谢与排卵障碍和卵巢储备有关。肝受体同系物-1(LRH-1)作为胆汁酸代谢的重要组成部分,在性腺发育和排卵过程中发挥作用,有研究发现PCOS患者颗粒细胞中LRH-1表达增高[31]。所有证据表明,胆汁酸代谢在PCOS患者的卵泡发育和卵巢功能中发挥重要作用。PCOS患者通常有类固醇激素代谢紊乱,其中HA在PCOS的发病机制中起核心作用。与正常女性比较,PCOS患者的卵泡液常表现为雄激素升高,而孕酮水平降低[3,27,32]。HA会严重影响PCOS患者的体征和代谢,也是引起PCOS患者排卵障碍的主要原因[33],PCOS女性卵泡液中过高的雄激素主要来源于卵巢[32]。Ge等[34]研究表明,与非高雄激素血症(NHA)的PCOS女性比较,伴有HA的PCOS女性卵泡液中雄烯二酮、总睾酮、二氢睾酮水平升高(P<0.05),3β-羟基类固醇脱氢酶Ⅱ型(3β-HSD2)和17β-羟类固醇脱氢酶3型(17β-HSD3)活性增强而5α-还原酶活性降低(P<0.05),并且发现LH/FSH比值与类固醇水平和酶活性具有相关性。Yu等[3]检测到多种类固醇激素,与对照组相比,PCOS患者卵泡液中雌三醇、雌二醇和孕烯醇酮水平显著升高而孕酮水平降低,外泌体中细胞色素P450家族成员11A1(CYP11A1)、细胞色素P450家族成员19A1(CYP19A1)和17-β-羟基类固醇脱氢酶1(HSD17B1)的mRNA水平与类固醇激素变化有相关性,其中CYP11A1和HSD17B1表达水平与优质胚胎率呈负相关,这表明类固醇激素通过改变外泌体中HSD17B1、CYP19A1和CYP11A1的表达影响PCOS患者的卵泡发育。

(三)氨基酸

1.芳香族氨基酸类:卵泡液中氨基酸变化会影响代谢途径中的重要信号分子、受体和酶活性,进而影响后续卵母细胞质量以及受精过程[6,35]。Hou等[35]研究发现在非肥胖和NIR的PCOS患者卵泡液中L-色氨酸和L-酪氨酸含量增加且与血清睾酮和雄烯二酮水平呈正相关,认为氨基酸代谢可以弥补TCA功能的不足。PCOS患者可通过激活色氨酸-犬尿氨酸途径引起中枢神经系统的炎症反应并改变神经内分泌功能[36]。此外,Sun等[37]发现PCOS女性卵泡中苯丙氨酸上调;苯丙氨酸代谢不仅对卵母细胞的生长发育至关重要,还与女性排卵功能障碍有关[28,38]。

2.支链氨基酸(BCAA)类:卵泡液中BCAA改变会影响卵巢局部代谢,进而影响妊娠结局。多项研究发现PCOS组卵泡液中BCAA水平增[6,39],但也有研究检测到BCAA水平降低[10]。Zhang等[12]研究表明优质胚胎率与亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸呈显著负相关。BCAA代谢与胰岛素分泌和胰岛素敏感性有关,与NIR的PCOS组相比,伴有IR的PCOS患者的亮氨酸、缬氨酸水平更高[39]。

3.肉碱:肉碱是一种特殊氨基酸,在PCOS的发病机制以及卵巢生理功能中发挥重要作用,肉碱也常用于PCOS的治疗。PCOS患者卵泡液中各类肉碱变化趋势不同,有研究发现L-棕榈酰肉碱、亚油酰肉碱、反式十六碳-2-烯基肉碱下调[6],而3-羟基壬酰肉碱则上调[37]。肉碱通过将脂肪输送到线粒体来加速脂肪燃烧和分解,补充肉碱可以调节PCOS患者体重进而有助于PCOS的治疗[40]。此外,也有研究表明,左旋肉碱和二甲双胍共同治疗可以改善枸橼酸克罗米芬耐药的PCOS患者的生育能力,并且在IR和脂质代谢方面具有协同作用[41]。

4.其他类别氨基酸:除以上氨基酸外,其他种类氨基酸也与PCOS有重要关联。Yu等[13]研究发现与正常对照组相比,痰湿阻滞型PCOS患者卵泡液中L-谷氨酸、N-乙酰基-L-天冬氨酸、D-脯氨酸上调。有研究表明,PCOS患者卵泡液中苏氨酸下调,并发现丙氨酸和天冬氨酸与体质量指数呈正相关,获卵数与天冬氨酸和谷氨酸呈正相关[10]。Zhang等[12]发现在PCOS组中谷氨酰胺和丙氨酸显著降低,且谷氨酰胺与优质胚胎率呈正相关。因此,氨基酸的研究为提高PCOS女性不良卵母细胞质量提供新思路。

四、卵泡液代谢组学在PCOS疗效评价方面的应用

卵泡液代谢组学既能发现PCOS潜在的生物标志物,又能预测胚胎发育潜能,而且还可以应用于PCOS的疗效评价。一项基于UHPLC-MS的非靶向代谢组学研究评价了穴位贴敷治疗痰湿型PCOS患者的临床疗效,结果表明治疗后假尿嘧啶核苷、苯酚、2-氧代己二酸、9R、10S-EpOME、DL-乳酸、烟酰胺、DL-3-吲哚乳酸水平均降低,临床上表现为Gn天数变少、可利用胚胎数增多,提示该治疗方法能有效改善痰湿型PCOS患者的临床症状和IVF治疗结局[13]。Ersahin等[42]研究表明枸橼酸氯米芬治疗的无排卵性PCOS患者卵泡液中乳酸水平增加而胆碱水平降低,并发现枸橼酸氯米芬治疗可能使PCOS患者卵丘卵母细胞复合体受损继而导致胆碱代谢发生改变,从而改善了PCOS患者的临床症状和妊娠结局。目前代谢组学已应用于PCOS的疗效评价,为PCOS的治疗提供了新的见解。

五、小结

PCOS已是一种全球性疾病,导致许多妇女不孕,但其病因复杂,目前尚未找到根治方法。PCOS患者常表现为内分泌代谢紊乱,因此研究PCOS相关代谢因子至关重要。进行IVF-ET的PCOS患者妊娠结局不理想,表现为受精率、着床率降低等。卵泡液作为卵母细胞生长的微环境,其代谢物的改变必然会影响卵母细胞发育以及受精的能力,但明确的关联性以及具体机制尚不清楚。近年来,随着代谢组学的不断发展和对PCOS患者卵泡液的深入研究,已发现了不同代谢途径中的多种代谢物。从小分子水平探讨PCOS的发病机制和卵母细胞的代谢途径,可以提高卵母细胞和胚胎质量,也为临床制定PCOS精准诊疗策略提供了新的思路和理论依据。