精子线粒体膜电位作为综合评估男性生育能力指标的初探

樊千，常凤娟，陈赟，孙志兴，张星，薛建国

(1.江苏省中医院,南京 210029;2.江苏省中医院男科生殖实验室,南京 210029;3.南京中医药大学,南京 210046)

2022年中国人口正式步入负增长时代,其中原因之一是长期的低生育率。如今大约14%的夫妻难以受孕,其中男方因素占半数以上[1-2]。一直以来,传统研究认为男性生育能力与精子浓度、精子前向运动(PR)、精子正常形态密切相关[3];世界卫生组织(WHO)为此专门公布了评价男性精液质量的正常参考值标准。但仍有相当比例的特发性男性不育症患者精液参数正常,这使得传统的精液参数检查并不能准确地反映精子的形态、结构和功能,同时也无法全面地评估男性自然生育潜力[4]。得益于荧光探针检测技术、流式细胞仪以及电子显微镜的发展和应用,临床和科研已经可以在微观层面观察精子细胞内能量代谢的重要部位——线粒体,并能开展反映精子线粒体内三羟酸循环、体现能量代谢状态的指标精子线粒体膜电位(MMP)研究。虽然精液常规分析和精子形态学检测仍是判断男性生育力的基础,但现有研究已表明精子MMP对男性生育力的评价可能更加全面和高效。目前,国内外对应用精子MMP作为综合评估男性生育潜力指标的研究较少,因此绘制精子MMP的受试者工作特征曲线(ROC),计算能综合评估男性生育潜力的截断值对临床诊断和治疗都有重要意义,本课题组对此进行了初步探索性研究,现报道如下。

资料与方法

一、研究对象

选择2023年4—7月于江苏省中医院男科门诊就诊并进行孕前优生健康检查、生育咨询的已婚男性以及初诊的男性不育症患者作为研究对象。

精液质量正常组纳入标准:年龄18～50岁;生殖器及附属性腺发育正常,性生活正常;精液量>2 ml、pH值7.2～7.8、精子浓度≥15×106/ml、PR≥32%、精子形态正常率≥4%、精子DNA碎片指数(DFI)<30%。精液质量异常组纳入标准:病程>1年;PR<32%、精子形态正常率<4%、精子DFI≥30%;就诊前未进行过生育方面治疗和用药。

排除标准:男性免疫性不育;内分泌功能异常;生殖器官先天畸形或精子排出障碍所引起的不育;生殖系统感染或因高温、辐射、油漆等明确因素所引起的死精子症;近3个月内服用抗癫痫、抗肿瘤等影响精子生成与存活的药物;合并严重心脑血管疾病、血液系统疾病;肝、肾功能不全者。

共纳入124例患者。根据不同精液质量分为两组:精液质量各项指标均正常,即精液量>2 ml、pH值7.2～7.8、精子浓度≥15×106/ml、PR≥32%、精子形态正常率≥4%、DFI<30%为精液质量正常组(n=57)。PR<32%、精子形态正常率<4%、DFI≥30%为精液质量异常组(n=67)。

所有样本均在征得患者知情同意下进行采集,其使用和处理均按南京中医药大学附属医院伦理委员会相关管理和监督条例及标准进行,取得伦理委员会审查(2023NL-094-02)同意。

二、主要试剂和仪器

流式细胞仪(ACEA/D2040R,北京安捷伦),计算机辅助精液分析系统(S3-3全自动精子质量分析仪,上海北昂),低速离心机(BY-G16型,河北白洋离心机厂),精子线粒体膜染色试剂盒(FC0711AR,成都赛雷纳)和精子核完整性染色试剂盒(FC9711A,成都赛雷纳)。

三、研究方法

1.精液常规检测:精液标本均在禁欲3～7 d手淫法留取,精液样本置于37℃水浴箱孵育,30 min后记录液化程度和时间、精液颜色,测量精液体积、pH值。取10 μl液化完全的精液样本至精子计数板,盖盖玻片后静置1 min,于光学显微镜下200倍视野下选择精子分布均匀的10个小方格分析PR并计算百分率。取10个小方格的总精子个数(N)除以每个样本所计数总排数(n)的体积乘以稀释倍数为精子浓度(C),C=(N/n)×(1/20)×稀释倍数,重复计算后取平均值。

2.精子形态学涂片及染色:用加样器吸取2～10 ml精液标本滴至载玻片一端5 mm处,采用拉薄技术进行涂片,静置后经空气干燥再浸入95%乙醇中固定15 min以上;计数200个精子,分别记录正常形态精子数目、头部缺陷、颈部缺陷和尾部缺陷精子数目,并统计精子缺陷总数,根据记录结果计算精子形态正常率,重复计数200个精子后取平均值,检测结果经审核后签发报告。

3.精子DFI检测:按试剂盒说明书,将液化的精液用37℃缓冲液稀释精子至1～2×106/ml;将500 μl稀释过的精子加入到流式细胞仪上样管中,加入酸化处理缓冲液30 s后加入试剂盒中的染色液;在酸化处理后利用吖啶橙染料与双链DNA结合发绿色或黄色荧光,与单链DNA结合发红色荧光的特性,确定精子DNA碎片化程度;设定流式细胞仪的校准,将检测管上机,每管样本至少连续测定两次,每管样本至少记录样本主群5 000个细胞并使用DFIView软件统计分析;染色后的精子细胞悬液通过流式细胞仪收集精子的红绿荧光信号(即FITC与PerCP荧光信号),通过收集到的红色荧光精子占收集精子总数的比例,判定样本的DFI。

4.精子MMP检测:按照精子线粒体膜染色试剂盒说明书,用0.01 mol/L、pH 7.4的PBS洗涤精液标本两次后,300g离心5 min,弃上清液后PBS重悬沉淀精子,将样本浓度调至1～2×106个/ml,试剂盒预先置于室温15 min,调节恒温水浴箱至37℃,85℃预热金属浴,每个样本准备并标记对照管和检测管。每管加l00 μl试剂盒中的A液后,加入精子样本取样量(μl)=1×108/浓度,将对照管置于金属浴85℃温育2 min后取出置于室温静置灭活,检测管置于室温。后对照管和检测管分别加入0.4 ml试剂A,再分别加入5 μl试剂B,混匀后均置于37℃水浴箱中,避光恒温孵育15 min染色。染色40 min内上流式细胞仪,激发波长为488 nm,通过荧光通道FL1(绿)和FL2(红)检测橙红色荧光强度,每个样本检测5 000个精子。

四、统计学分析

结 果

一、两组精液参数比较

两组间平均年龄、精液量比较均无显著差异(P>0.05),精液质量正常组精子浓度、PR、精子形态正常率、MMP显著高于精液质量异常组,DFI显著低于精液质量异常组(P<0.05)(表1)。

表1 两组精液参数比较(-±s)

二、MMP与各精液参数相关性比较

Spearman相关性分析结果显示,MMP与精子浓度(r=0.396,P<0.001)、PR(r=0.471,P<0.001)、精子正常率呈正相关(r=0.468,P<0.001),与DFI(r=-0.701,P<0.001)呈负相关,与精液量无明显相关性(P>0.05)(表2、图1)。

图1 MMP与精液各参数相关性散点图

表2 MMP与各精液参数相关性比较

三、MMP评估、预测男性生育能力的ROC

为了分析MMP作为评估总精液质量及其各项指标(精子浓度、PR、精子形态正常率、DFI)的评估价值,分别绘制ROC曲线。MMP预测总的精液质量的ROC最大AUC为0.891,截断值为53.69%;MMP预测精子浓度的AUC为0.787,截断值为43.97%;MMP预测PR的AUC为0.741,截断值为56.33%;MMP预测精子形态正常率的AUC为0.733,截断值为56.63%;MMP预测DFI的AUC为0.809,截断值为54.78%(图2,表3)。

图2 ROC曲线

表3 MMP对男性精液各项指标及生育能力诊断价值

讨 论

一、MMP是反映精子线粒体功能的重要指标,采用流式细胞术能高效、便捷地开展大规模临床检测

精子在形成、成熟的过程中,大多数线粒体都会随多余细胞质一同丢失,最终在成熟精子中仅保留22～75个线粒体呈螺旋式排列分布在精子尾部中段形成精子线粒体鞘[5]。精子线粒体是精子运动能量的主要来源,同时也发挥着精子能量代谢、氧自由基生成、三羟酸循环、氧化磷酸化以及多种离子跨膜转运的重要作用[6]。MMP是精子线粒体内三羟酸循环过程中线粒体内膜基质侧泵到内膜外所形成的跨膜电位差[7],能直接反映了精子活力的高低[8]。商学军等[9]最早在国内开展利用荧光探针罗丹明123(Rhodamine123,Rh123)检测精子MMP的研究并发现活性氧(ROS)会通过对MMP的影响损伤线粒体功能。夏欣一等[10]采用流式细胞术应用荧光染料5,5′,6,6′-四氯-1,1′,3,3′-四乙基苯并咪唑基-羰化青碘(JC-1)对MMP进行检测研究,并证实,JC-1相比Rh123是一种的特异性和灵敏性更高的荧光探针,其红绿荧光强度比率不易受线粒体差异的干扰。得益于流式细胞术的高效、便捷,荧光探针检测MMP更加适合临床应用和生殖实验室开展大样本量规模性检测[11]。

二、MMP与精子浓度、PR、精子形态正常率呈显著正相关,与DFI呈显著负相关,不仅能体现精子能量代谢状态更能反映精子凋亡程度

精液常规和精子形态学检测仍是临床中评估男性精子质量和预测男性生育潜力的重要手段,但临床上仍有很多精液参数正常的男性无法生育且原因不明,甚至WHO在第5版指南中下调了相关参数的参考值下限。近年来越来越多的研究支持将精子MMP作为评估和预测男性生育能力的重要新指标。刘宇等[12]论述了精子MMP比精液常规参数更能直接反映男性生育能力,对于临床上评估男性生育力具有重要意义。Kasai等[13]对原因不明的不育症男性精液质量研究发现,精子MMP与精子活力呈正相关。该结论也得到了Zhang等[14]的验证。Sharbatoghli等[15]在ICSI治疗中发现,精子MMP与精子活率和精子浓度均呈正相关。本研究结果证实,精子MMP与精子浓度和PR呈显著正相关(P<0.05),这可能是因为MMP与精子线粒体内三羟酸循环和氧化磷酸化密切相关,是促使ATP正常生成的重要条件;当MMP因为各种原因降低时,精子线粒体两侧电势能降低,ATP产生障碍,精子鞭毛供能不足,导致精子活动力下降进而影响受孕率。本研究结果显示,精子MMP与精子形态正常率呈显著正相关(P<0.05),与DFI呈显著负相关(P<0.05)。此结果与Zhang等[14]研究结果相一致。这可能与氧化应激刺激和随之而来的损伤导致的精子线粒体介导的细胞凋亡程序启动相关,当精子线粒体受刺激强度超过耐受极限时,线粒体通透性转换孔开放引起精子MMP下降,该现象发生在染色质浓缩、DNA断裂等细胞核凋亡特征之前,且线粒体一旦崩溃,精子细胞凋亡过程将不可逆转,最终导致精子畸形率和DFI升高导致不育[16-19]。本研究结果发现,精子MMP与DFI Spearman相关系数高于其他精液质量指标,也从侧面佐证上述结论。

三、精子MMP能更全面地反映精液质量、评估和预测男性生育能力,在临床中推荐将54%作为精子MMP参考值下限用于综合评估和预测

男性精液质量的优劣与生育能力直接相关,ROC曲线分析结果显示,精子MMP预测精液质量整体水平的AUC为0.891,敏感度和特异性较高,有较好预测价值。当MMP≥54%时,检测者精液质量和功能均趋向正常,临床生育能力趋向正常;对于以生育前检查和生育咨询为目的的检测者推荐通过精子MMP初步整体评估生育能力,将比全面的检查精液常规、精子形态学和DFI更具有经济性价比和便捷性。本研究结果与钱路杰[20]研究结果(MMP参考下限为50.7%)、Kasai等[13]研究结果(MMP参考下限值为52%)基本相近但仍有一定差别。分析原因为:(1)上述学者的研究以既往是否生育、精子活动力以及精子形态学参数分别为分组标准,未将DFI纳入分析;(2)不同品牌试剂盒之间检测差异性大。我们将在后续研究中纳入更多数据并比较不同品牌的试剂盒结果,以期得到更准确的大样本MMP临床数据,为综合评估和预测男性生育能力提供临床参考依据。当MMP<54%时,建议进一步完善精液常规参数、精子形态学、DFI和生育相关基因检测。目前,将MMP作为综合评估男性不育、优化辅助生殖技术方案的指标也已经得到了国内同行的认可[21]。

综上所述,精子MMP是线粒体功能的重要指标,与精子浓度、PR、精子形态正常率和DFI均密切相关,既能体现精子的能量代谢状态还能反映精子凋亡,在临床工作中推荐采用流式细胞术检测MMP并将参考值下限设为54%,能比各单项精液指标更加全面、高效地评估和预测男性生育能力。