地榆皂苷Ⅱ抑制结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭和诱导凋亡的体外实验研究
2024-03-01钟新强肖海鹏陆艳军吴安定
钟新强, 陈 康, 杜 恒, 肖海鹏, 陆艳军, 吴安定
(湖北省黄冈市中心医院, 1. 胃肠外科, 2. 药剂科, 湖北 黄冈, 438000)
结肠癌是临床上最常见的消化道恶性肿瘤之一,近年来全球发病率、病死率显著提升[1-2]。中国结肠癌的发病率和病死率仅次于肺癌和胃癌[3]。结肠癌多发于男性,发病高峰年龄段为40~50岁[4]。早期结肠癌可通过内镜微创治愈,然而早期无典型的临床症状,缺乏有效的诊断策略[5]。多数结肠癌患者确诊时已为中晚期,已发展为转移性结肠癌,临床治疗以手术为主,多数患者临床预后较差。中药的多种活性成分可对抗肿瘤增殖,开发安全高效的抗肿瘤中药已成为目前研究的热点[6]。地榆皂苷Ⅱ是从地榆中分离出来的具有抗氧化应激、抗溃疡、促进细胞凋亡和抗肿瘤作用的三萜皂苷类化合物,可有效改善放化疗造成的外周血细胞减少症状[7]。细胞中蛋白激酶B (AKT)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)信号通路是机体内细胞生存的重要信号通路之一,与肿瘤细胞增殖及细胞凋亡密切相关[8]。本研究探讨地榆皂苷Ⅱ对结肠癌细胞株HT-29增殖、迁移、侵袭和凋亡的作用,并探讨其作用机制是否与调控AKT/PI3K信号通路有关。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 细胞株: 人结肠癌细胞株HT-29购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞库。将HT-29细胞株复苏,用含有10%胎牛血清的DMEM培养基在37 ℃、5%CO2恒温培养箱中进行培养,每2~3 d换1次培养液,用胰蛋白酶消化传代,取对数生长期细胞进行实验。
1.1.2 实验药物: 地榆皂苷Ⅱ(纯度>98.0%)购自上海纯优技术有限公司。地榆皂苷Ⅱ用二甲基亚砜(DMSO)配成100 mmol/L母液,分装后于-20 ℃保存。实验前用培养液配成所需浓度(DMSO终浓度< 0.1%)。
1.1.3 主要试剂: DMSO购自美国Sigma公司; DMEM培养液和胎牛血清购自美国Gibco 公司; CCK-8试剂盒和异硫氰酸荧光黄(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒,购自武汉亚科因生物科技有限公司; Transwell小室购自美国Corning公司; 0.25%胰蛋白酶液、RIPA细胞裂解液和BCA蛋白定量试剂盒购自上海研谨生物科技有限公司; TRIzol试剂、RIPA蛋白裂解液、BCA试剂盒购自上海研谨生物科技有限公司; β-actin一抗、辣根过氧化物酶标记的IgG抗体(二抗)、SDS-PAGE凝胶配制试剂和SDS蛋白上样缓冲液,购自碧云天技术(上海)有限公司; 逆转录试剂盒和qRT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司; AKT抗体、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)抗体、PI3K抗体、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶(p-PI3K)抗体购自英国Abcam 公司; Caspase-9抗体、Cleaved-Caspase-9抗体、Caspase-3抗体和Cleaved-Caspase-3抗体购自美国CST公司; PVDF膜和ECL化学发光底物,购自美国Millipore 公司。AKT、PI3K、Caspase-3、Caspase-9和GAPDH引物均由广州锐博生物科技有限公司合成,引物序列见表1。
表1 qRT-PCR引物序列
1.1.4 主要仪器: MS204TS/02型电子分析天平,购自瑞士Mettler Toledo公司; 3111型CO2恒温培养箱、Legend Micro17R型低温高速离心机和NanoDrop 8000型超微量分光光度计,购自美国Thermo Fisher Scientific公司; IX73-DP80型倒置显微镜购自日本Olympus公司; NovoCyte D3000型流式细胞仪购自美国Agilent Technologies公司; Light Cycler 480Ⅱ型荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪购自瑞士Roche公司; Milli-Q IQ7003型超纯水系统购自德国Merck公司; Trans-Blot Turbo型Western-blot 电泳仪、转膜仪和ChemiDoc MP化学发光凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞增殖实验: 将HT-29细胞悬液接种于96孔培养板,加入地榆皂苷Ⅱ(终浓度为0、1、5、10、20、40、60和80 μmol/L)培养24 h或48 h, 每孔加入CCK-8溶液10 μL继续培养1 h, 用分光光度计检测每孔在450 nm波长处的光密度(OD)值,计算各浓度榆皂苷Ⅱ对HT-29细胞增殖的抑制率(IR)。IR=(OD空白组-OD药物组)/OD空白组×100%。
1.2.2 细胞迁移实验: 将HT-29细胞悬液接种于6孔板内,培养至细胞完全贴壁后用200 μL枪头划垂直划痕,于显微镜下观察划痕宽度并拍照,用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次,更换为含地榆皂苷Ⅱ(终浓度为0、5、10和20 μmol/L)的新鲜培养基培养48 h, 显微镜下观察划痕弥合情况并拍照,计算相对迁移率。相对迁移率=(初始划痕宽度-48 h划痕宽度)/初始划痕宽度×100%。
1.2.3 细胞侵袭实验: Matrigel胶经无血清培养基稀释后预涂覆于Transwell上室,待胶完全凝固后, Transwell下室加入含地榆皂苷Ⅱ(终浓度为0、5、10和20 μmol/L)的完全培养基600 μL。将对数生长期的HT-29细胞悬液分别按照1×105个/mL在Transwell上室中加入100 μL细胞悬液。上室和下室用聚碳酸酯膜隔开,放入恒温培养箱内(37 ℃和5%CO2)培养48 h。取出上室并弃掉培养液,冲洗后用棉签擦去细胞与Matrigel胶,固定细胞,结晶紫染液染色,在倒置显微镜下选取5个视野计数穿过小室的细胞数并计算每个视野的平均细胞数,计算各组相对侵袭率。相对侵袭率=(试验组侵袭细胞数量/空白组侵袭细胞数量)×100%。
1.2.4 细胞凋亡实验: 将HT-29细胞接种于6孔板内,加入地榆皂苷Ⅱ(终浓度为0、5、10和20 μmol/L)处理48 h, 采用0.25%胰酶消化并收集细胞,以PBS冲洗3遍,将细胞悬浮在结合缓冲液500 μL内,然后加入Annexin V-FITC和PI进行染色,室温下避光培养15 min, 加入Binding Buffer工作液。用流式细胞仪在488 nm下进行检测,利用Novo Express软件进行分析。
1.2.5 定量聚合酶链反应(qPCR)实验: 将HT-29细胞悬液接种于6孔板内,加入地榆皂苷Ⅱ(终浓度为0、5、10和20 μmol/L)培养48 h, 采用0.25%胰酶消化并收集各组细胞,用PBS清洗细胞后采用TRIzol试剂提取RNA。采用超微量分光光度计测定260 nm和280 nm处的OD值(OD260 nm/OD280 nm: 1.8~2.0)。参照逆转录试剂盒说明书,将RNA逆转录为cDNA。逆转录条件为: 37 ℃, 15 min; 85 ℃, 5 s; 4 ℃ 10 min。取cDNA 2 μL、上下游引物各1 μL、TB Green Premix Ex TaqTM Ⅱ 12.5 μL和灭菌水8.5 μL组成的反应体系按照SYBR Green qPCR试剂盒说明书进行qRT-PCR。PCR条件: 95 ℃变性15 s, 60 ℃ 退火60 s, 72 ℃ 60 s, 共40个循环, 72 ℃延展5 min。以GAPDH作为内参,采用2-△△Ct法计算AKT、PI3K、Caspase-3和Caspase-9mRNA的相对表达量。
1.2.6 Western blot实验: 将HT-29细胞悬液接种于6孔板内,加入地榆皂苷Ⅱ(终浓度为0、5、10和20 μmol/L)培养48 h, 0.25%胰酶消化并收集细胞,加入RIPA裂解液冰上裂解30 min, 离心,收集上清液。BCA法进行蛋白定量, -20 ℃保存。将蛋白样品煮沸变性,取50 μg于SDS-PAGE凝胶电泳,然后转移至PVDF膜,于室温下用5%脱脂牛奶封闭2 h, TBST溶液洗膜(10 min/次×3次),分别加入AKT抗体、p-AKT抗体、PI3K抗体、p-PI3K抗体、Caspase-9抗体、Cleaved-Caspase-9抗体、Caspase-3抗体和Cleaved-Caspase-3抗体于4 ℃培养过夜,TBST洗膜3次,加入二抗室温反应1 h。TBST洗膜3次,用ECL plus试剂发色液显色,采用Chemi-Doc Imaging System进行检测。
1.3 统计学处理
2 结 果
2.1 地榆皂苷Ⅱ对结肠癌HT-29细胞增殖的抑制作用
地榆皂苷Ⅱ(0、1、5、10、20、40、60和80 μmol/mL)与结肠癌HT-29细胞培养24 h或48 h均对HT-29细胞增殖产生显著抑制作用(P<0.05), 且具有剂量依赖性,见表2。
表2 地榆皂苷Ⅱ抑制结肠癌HT-29细胞增殖作用的测定结果 %
2.2 地榆皂苷Ⅱ对结肠癌HT-29细胞迁移能力的影响
地榆皂苷Ⅱ(5、10和20 μmol/mL)具有显著抑制结肠癌HT-29细胞迁移的能力(P<0.05), 且具有剂量依赖性,见表3。
表3 地榆皂苷Ⅱ抑制结肠癌HT-29细胞迁移作用的测定结果
2.3 地榆皂苷Ⅱ对结肠癌HT-29细胞侵袭能力的影响
地榆皂苷Ⅱ(5、10和20 μmol/mL)可剂量依赖性显著抑制HT-29细胞的侵袭能力(P<0.05), 见表4。
表4 地榆皂苷Ⅱ抑制结肠癌HT-29细胞侵袭作用的测定结果
2.4 地榆皂苷Ⅱ对结肠癌HT-29细胞凋亡的影响
地榆皂苷Ⅱ(5、10和20 μmol/mL)可显著促进HT-29细胞凋亡(P<0.05), 并呈剂量依赖性,见表5。
表5 地榆皂苷Ⅱ促进结肠癌HT-29细胞凋亡作用的测定结果
2.5 地榆皂苷Ⅱ对结肠癌HT-29细胞中AKT/PI3K信号通路相关mRNA表达的影响
地榆皂苷Ⅱ(5、10和20 μmol/mL)可剂量依赖性降低HT-29细胞中AKT和PI3KmRNA的表达,增加Caspase-3和Caspase-9mRNA的表达,差异有统计学意义(P<0.05), 见表6。
表6 结肠癌HT-29细胞中AKT/PI3K信号通路相关mRNA表达水平的测定结果
2.6 地榆皂苷Ⅱ对结肠癌HT-29细胞中AKT/PI3K信号通路蛋白表达的影响
地榆皂苷Ⅱ(5、10和20 μmol/mL)可剂量依赖性降低HT-29细胞中p-AKT和p-PI3K蛋白的表达,并增加Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9蛋白的表达,差异有统计学意义(P<0.05), 见表7。
表7 地榆皂苷Ⅱ调节结肠癌HT-29细胞中AKT/PI3K信号通路蛋白表达水平的测定结果
3 讨 论
结肠癌是临床最常见恶性肿瘤之一,且近年来发病率和病死率呈逐年上升的趋势。由于结肠癌早期症状不明显,并且缺乏早期诊断手段,侵袭性高且易转移,临床确诊时多数患者已经发展为中晚期,治疗效果较差。目前,结肠癌的治疗方法主要为手术切除、化学治疗和物理治疗等。虽然手术治疗为结肠癌的首选方案,但是中晚期患者多数不适宜接受手术治疗,常以放化疗或药物控制肿瘤的发展[9]。
传统中药中发现很多有效成分,可以抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭,诱导肿瘤细胞凋亡并且选择性地针对恶性增殖基因的有效靶点,成为肿瘤治疗的新策略。地榆为蔷薇科植物地榆或长叶地榆的干燥根,其中以地榆皂苷I和地榆皂苷Ⅱ为代表的三萜皂苷类是地榆中重要的生物活性成分之一。地榆皂苷是从地榆中分离提取出来的一类具有明显药理活性的三萜皂苷类化合物,主要包括地榆皂苷I和地榆皂苷Ⅱ。地榆皂苷Ⅱ除了具有升高红细胞、收缩血管、抗真菌等药理作用外[10], 还对多种肿瘤细胞具有抑制作用。吴泽承等[11]研究显示,地榆皂苷Ⅱ对人舌鳞癌细胞CAL27的增殖能力具有抑制作用。王振龙等[12]研究显示,地榆皂苷Ⅱ对于乳腺癌细胞具有抑制作用,其可通过激活线粒体凋亡途径诱导乳腺癌细胞凋亡。此外,地榆皂苷Ⅱ通过抑制AKT/PI3K信号通路活性有效抑制鼻咽癌细胞的增殖[13], 通过抑制AKT/PI3K信号通路激活线粒体凋亡途径促进神经母细胞瘤SK-N-SH细胞凋亡[14]。目前对于地榆皂苷Ⅱ是否对结肠癌细胞TH-29增殖、迁移和侵袭具有抑制作用及其作用机制国内鲜有报道。
肿瘤细胞的无限增殖、迁移和侵袭是恶性肿瘤主要生物学特性,复发、转移是结肠癌相关死亡的主要原因,而复发转移与结肠癌细胞上述生物学特性密切相关。已有研究[15]显示,地榆皂苷可剂量依赖性抑制结肠癌细胞HCT-116和SW-480细胞的增殖。本实验结果显示,地榆皂苷Ⅱ可剂量依赖性抑制结肠癌细胞HT-29的增殖、迁移和侵袭能力。细胞凋亡是机体常见的正常生理过程,正常情况下可通过清除受损或多余的细胞保证机体的正常生长发育。肿瘤的产生由细胞增殖和死亡失衡导致,其中细胞凋亡受到抑制是非常重要的原因。本实验结果显示,地榆皂苷Ⅱ可剂量依赖性促进结肠癌细胞HT-29的凋亡。
AKT/PI3K信号通路是机体内细胞生存的重要信号通路之一,该信号通路的激活可促进肿瘤细胞增殖及抑制细胞凋亡,与结肠癌发生及发展密切相关。Caspases是在细胞凋亡中发挥关键作用的酶家族[16]。Caspase-9是凋亡级联效应上游的主要启动因子, Caspase-3被认为是Caspase家族成员中最重要的凋亡执行者,而Caspase-3 活化又主要依靠凋亡启动因子Caspase-9 的激活[17]。抑制AKT/PI3K信号通路的过度激活可促进Caspase-9活化从而上调Caspase-3的活性,最终诱导细胞凋亡[18]。本研究结果显示,地榆皂苷Ⅱ可剂量依赖性降低结肠癌细胞HT-29中AKT和PI3KmRNA的表达,增高Caspase-3和Caspase-9mRNA的表达,并且可剂量依赖性地降低结肠癌细胞HT-29中p-AKT和p-PI3K蛋白的表达,增加Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9蛋白的表达,说明地榆皂苷Ⅱ发挥作用可能与促进AKT和PI3K蛋白磷酸化、Caspase-3和Caspase-9蛋白活化而调节AKT/PI3K信号通路有关。
综上所述,地榆皂苷Ⅱ可抑制结肠癌细胞HT-29的增殖、迁移、侵袭,促进细胞凋亡,可能与通过促进AKT和PI3K蛋白磷酸化、Caspase-3和Caspase-9蛋白活化而调节AKT/PI3K信号通路有关。