等温滴定量热法研究镉离子与GMP 的亲合机理

于劲松，黄 煦，任方圆，黎瑛婕，李朝霞，阿丽娅，吕欣欣，曹 慧，袁 敏，叶 泰，吴秀秀，郝丽玲，徐 斐

上海理工大学健康科学与工程学院/上海食品快速检测工程技术研究中心，上海，200093

镉离子作为一种对人体危害性极大的重金属离子，是一种世界公认的严重污染物，并且很多产品都设立了对镉含量的限值[1-2]。目前已有的检测手段，都需要经历较为复杂的前处理过程，将镉离子富集和分离[3-5]。而离子印迹技术作为一种重要的重金属检测技术已逐渐被运用于很多关键领域，离子印迹技术一般以离子为模板，通过静电作用和配位作用等手段与功能单体结合，形成螯合物，之后以酸性试剂为洗脱剂，将模板离子从螯合物上洗脱[6-8]。最终制备出具有与目标金属离子相对应的三维孔穴结构的离子印迹聚合物[9]。现如今，离子印迹技术已逐渐被应用于食品，分析化学，工业废水治理等领域[10-11]。

但值得注意的是，离子印迹检测技术仍需要进一步完善，其主要问题在于金属离子半径过小，且各种金属离子结构相近，导致目前常用的功能单体都无法做到将特异性与模板离子的特异性相结合[12-13]。基于此。本研究的主要目标就是探究重金属镉离子和功能单体鸟嘌呤核糖核苷酸（GMP）的结合机理，为筛选出可以与镉离子的特异性结合的优秀功能单体提供理论基础和实验基础。

研究中采用等温滴定量热法研究二者的亲合机理。等温滴定量热法（ITC）是一种直接测量双分子反应过程中热量释放或消耗的物理技术，是一种在恒定温度下配体与大分子接触的分析方法[14-15]。它根据热力学的基本原理工作，两个分子之间的接触会导致热量产生还是吸收，往往取决于结合的类型，即放热或吸热[16-17]。通过对ITC 结果进行分析，可以定量测定分子结合过程中的化学计量比（N）、亲合常数（K）、焓变（ΔH）和熵变（ΔS）等参数[14]。获取的这些参数将为研究镉离子与单体的亲合机理提供直接的热力学数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氯化镉、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）及氢氧化钠均购自国药基团化学试剂有限公司；鸟嘌呤核糖核苷酸（GMP）购自上海宝曼生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

等温滴定量热仪（ITC200）（美国马尔文仪器有限公司）；Heraeus TMFresco TM17 离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）；Brand 普兰德单道可调移液器（德国普兰德Brand 有限公司）；磁力搅拌器（IKA）、pH 计（梅特勒托利多）。

1.3 实验步骤

（1）溶液配制：用pH 7.5 的HEPES 缓冲溶液按实验所需配制不同浓度的氯化镉和GMP 溶液。

（2）溶液脱气：因为等温量热滴定法测量的是微量反应热，溶液中含有气泡会使实验结果存在较大的误差。为了预防产生误差，在实验开始前，需要对溶液进行离心，这样不仅可以使溶液体系均匀，还可以去除其中的气泡。在配制完溶液后，将其放入离心机中，在25 ℃的条件下，离心5 min。

（3）样品池加样：使用专用进样针抽取离心管中的样品，在抽取过程中要尽量保证进样针内无气泡进入，抽取之量大概为样针的三分之二。抽取完毕后，将进样针插入样品池中，缓慢匀速地将样品推入样品池中，直到样品与样品池等高。之后用针筒的针头缓慢搅动样品池，排出样品池中的气泡。

（4）滴定注射器加样：在样品进样完毕之后，将装有滴定物的PCR 管放到仪器的对应孔中，仪器就会自动抽取一定体积的滴定物。在仪器抽取完滴定物之后，需确认滴定注射器内是否含有气泡，如果有，则需操作仪器重新取样，直到滴定注射器中没有气泡。

（5）进行等温量热滴定实验：在滴定物装载完毕后，将滴定物注射器插入样品池中，按照提前设定好的滴数和相关参数将滴定物加入样品池中，用滴定物注射器进行搅拌，使滴定物和被滴定物充分结合。

（6）数据处理：将通过ITC 得到的热反应曲线导入ITC200 配套的original 软件中，通过软件计算得出反应热曲线的各项数值，结合常数K，化学计量比N，焓变ΔH，熵变ΔS。

1.4 试验设计

本研究选用的缓冲液为非离子缓冲液HEPES。非离子型缓冲液可以减少实验过程中缓冲背景对电导率测试的干扰。为了研究GMP 与镉离子的作用机理，实验分别选取四种比例浓度的GMP 和镉离子进行反应，分别为：5∶1、8∶1、10∶1 和20∶1，即将5、8、10、20 mmol/L 的氯化镉分成20 滴逐滴加到1 mmol/L 中的GMP 中。其中探针中氯化镉的总体积为40 μL，除了第一滴为0.4 μL 外，其他19 滴都为2 μL，GMP 的体积为210 μL。

此外，还需进行背景滴定实验。分别用5、8、10、20 mmol/L 的氯化镉滴定实验所用的缓冲溶液HEPES，使最终结果扣除背景的影响。背景扣除也是采用ITC200 配套的original 软件进行的。

2 结果与讨论

2.1 不同比例的镉离子与GMP 的等温滴定量热研究

2.1.1 镉离子和GMP 浓度比为5∶1 时的ITC 实验研究

图1 是镉离子和GMP 浓度比为5∶1 时的ITC滴定曲线和OneSite 模型拟合结果，图中上半部分的两条曲线分别为镉离子滴加到缓冲液中所产生的背景热量和镉离子与GMP 结合产生的热量变化曲线。两条曲线本来都是以纵坐标0 为基线的，但为了方便比较，都将背景热量向上平移了4 个单位，之后的几组数据也采用了同样的处理方式。在整个实验过程中，一共向GMP 中滴加了20 滴镉液，除了第一滴镉液是用来确定基线的，之后每一个峰都代表着一滴镉液滴加到GMP 中所产生的热量变化。在这个浓度比中，每个反应峰都在基线以下，说明电源代偿的功率为负值，参比池的温度低于样品池，由此得知此过程为放热反应。而终点的峰并未返回基线，说明在这个浓度比中，GMP 未全部与镉离子结合。

图1 镉离子和GMP 浓度比为5∶1 时的ITC 图谱

图1 的下半部分，是将图1 上半部分两条热量变化曲线的每个峰值相减，再积分求它们的面积，最后得到19 个数值，拟合出来的就是下边的曲线，它反映了整个结合过程中的热量变化。图的纵坐标为反应的热量，横坐标为摩尔比率，在该反应过程中，曲线斜率变化不大，说明该反应是以一种较为均匀的速度进行的。右边方框里的四个数值分别为结合常数K，化学计量比N，焓变量ΔH，熵变量ΔS。N 值反应了镉离子与GMP 的反应比例，K 值反应了镉离子与GMP 结合的性能。在此反应中K 值大约为1.51E 3，说明其结合性能并不理想。焓变值ΔH 和熵变值ΔS 分别代表整个反应过程中的热量变化和体系混乱程度的变化，在此浓度中，ΔH＜0，ΔS＞0，根据吉布斯函数公式ΔG=ΔH-TΔS，ΔG＜0，说明该反应是一个以焓变为主要驱动力的自发反应，可以在任何条件下自发进行。

2.1.2 镉离子和GMP 浓度比为8∶1 时的ITC 实验研究

图2 是镉离子和GMP 浓度比为8∶1 时ITC 滴定曲线和OneSite 模型的拟合结果，从上半部分的两张图可以看出，比值为5∶1 时，该浓度下热量变化曲线的最后几个峰已经接近基线了，但还没有完全回到基线，说明GMP 仍未反应完全。

图2 镉离子和GMP 浓度比为8∶1 时的ITC 图谱

从图下半部分的曲线可以看出，一开始斜率较大，之后慢慢趋于平缓，进入了一个平台期。而右边的图框显示N 值变小了，这是由于镉离子的浓度变高，其化学计量比下降了。而K 值增加（8.92E 3），说明在该浓度下，镉离子与GMP 的结合更加稳定了。同时表明，该反应也是一个以焓变为主要驱动力的自发反应。

2.1.3 镉离子和GMP 浓度比为10∶1 时的ITC 实验研究

图3 是镉离子与GMP 的浓度比为10∶1 时ITC 滴定曲线和OneSite 模型的拟合结果，该图相较于上述两个浓度的ITC 曲线明显不同。从上半部分的图可以明显看出整个反应从放热反应变为了吸热反应。但在第一个吸热峰之后存在一个小的放热峰，所以推测可能同时存在吸热和放热两种反应。

图3 镉离子和GMP 浓度比为10∶1 时的ITC 图谱

从图的下半部分来看，曲线的构型与前两个浓度正好相反，说明在该浓度下，而者的结合反应发生了变化。而从图中的拟合参数可知，N 值高达1.89，几乎是前两个浓度的N 值的两倍，说明镉和GMP的结合比例大约为2∶1。该浓度比例下，K 值是前两个浓度的10 倍，但K 值的误差也较大，为6.01E 4±1.50E 5，说明该比例下的拟合结果不理想。

2.1.4 镉离子和GMP 浓度比为20∶1 时的ITC 实验研究

图4 是镉离子和GMP 的浓度比为20∶1 时ITC 滴定曲线和OneSite 模型的拟合结果。从图中上半部分的滴定曲线可知，镉离子与GMP 的结合延续了10∶1 的浓度比，一开始为吸热反应，且反应迅速；第6 滴之后，滴定曲线显示，二者的结合过程从吸热反应变成了放热反应；且在第9 滴之后反应趋于稳定，基本与滴定的背景结果值一致。

图4 镉离子和GMP 浓度比为20∶1 时的ITC 数据

从图3 下半部分的模型拟合结果可知，N 值为0.998，说明镉离子与GMP 是接近并按照1∶1 的比例结合的。该比例下拟合得到的K 值为1.21E 4±2.26E 3，拟合误差小，结果较为理想。

2.2 不同比例镉离子和GMP 反应的热力学拟合结果分析

表1 的结果显示了不同比例的镉离子与GMP反应的各个热力学参数，通过比较四组数据，研究发现当体系中镉离子浓度较低、GMP 浓度较高时，反应为放热反应。反应化学计量比也在1 以下，说明此时大分子GMP 与镉应该只有1 个结合位点，这个结合位点与镉离子结合会产生放热反应。但当体系中镉离子浓度升高且GMP 浓度降低到一定比例时，反应就会变成吸热反应，同时N 值也会突然升高到1.89，此时镉离子与GMP 的化学计量比将近2∶1，即一个GMP 结合两个镉离子，说明此时GMP 与镉离子可能存在两个结合位点。在其他人研究中也出现了类似的情况，周洁和王延华等[18]在用ITC 研究Zn 离子和血清蛋白的结合机制时，发现在反应浓度较低时，只发生放热反应，但当浓度升高到一定比例时，会同时出现吸热和放热反应。他们推断血清蛋白和Zn 离子有吸热和放热两种结合位点，在浓度较低时，只有放热结合位点会发生反应，而当浓度升高到一个适当的比例时，放热反应产生的热会“激活”吸热位点，同时发生吸热和放热结合。

表1 不同比例镉离子和GMP 反应的热力学拟合参数

从热力学的角度进行分析，在5∶1 和8∶1 时，ΔH＜0，ΔS＞0，根据吉布斯函数，该反应在任何情况下都可以自发进行，而到10∶1 和20∶1 时，ΔH＞0，ΔS＞0，该反应只有温度T 大于一定程度才会自发发生。而分析下图的纵坐标得知，起始热量会随浓度上升而越来越高，说明初始温度上升，会使吸热结合位点自发发生反应。

因此，我们推测在本实验中GMP 和镉也可能同时含有吸热和放热两个结合位点，但在浓度较低时，只有放热结合位点发生结合，N 值小于1。但当浓度到达一个适合的比例时，GMP 的另一个吸热结合位点就会被激活，此时溶液会同时发生吸热和放热两种结合，且由于吸热位点的结合能力较放热位点强很多（K 值较大），反应以吸热为主，这也可以解释结合常数K 在反应变为吸热反应后突然上升的现象。而当反应体系中镉离子的浓度进一步升高时，镉离子只与结合能力强的吸热位点结合，N 值又回到了1 以下。当然此结论都是基于GMP 有吸热和发热两种结合位点的假设，具体结论还有待研究。

2.3 反滴法研究镉离子与GMP 的结合机理

为了进一步研究镉离子与GMP 的结合机理，我们采用反滴法，以GMP 为滴定物，镉离子为被滴物，选择1∶10 的浓度比进行试验。滴定和拟合结果如图5 和表2 所示。

表2 正滴法和反滴法反应的热力学拟合参数对比

图5 反滴法（GMP→Cd）浓度比为10∶1 时的ITC图谱

不同于正滴法，再10∶1 的浓度下，二者的结合过程依然是放热反应，且反应速度很快，8 滴之后反应基本就结束了。其热力学参数与正滴法中的放热反应相似，结合常数K 为6.05E 3±2.38E 3，介于正滴法的5∶2 和8∶1 之间。焓变ΔH＜0，熵变ΔS＞0，ΔG＜0，得知该过程也是一个以焓变力为主要驱动力的自发反应。因为是反滴法，此时的化学计量数与正滴法互为倒数，换算成正滴法应为2.3，说明此时可能已经出现两个结合位点，但吸热结合位点的活度不够，整体反应还是以放热为主。但反应的焓变相较于前两种浓度已经降低了很多，且反应的后半段已经出现了吸热小峰。该体系很可能正处于放热反应和吸热反应的交界点附近。总体而言，在同样的浓度比下，反滴法的结果与正滴法存在很大的差距，说明反应样品的加入顺序对整个反应有显著影响。

3 结论

离子印迹技术作为一种特异性检测和重金属离子去除技术，目前所面临的主要难点在于其对功能单体的选择，常用的几种分子印迹聚合物都无法很好地与重金属离子的特异性结合，而国内外关于相关功能单体的研究仍主要集中于单体性能，缺乏对结合机理的深入探究。本文通过研究镉离子与GMP的结合机理，希望可以为之后功能单体的选择研究提供一些帮助。

从研究中得出的主要结论如下：镉离子和GMP的浓度比不同会对二者的结合过程产生显著影响，在低浓度比下，反应为焓驱动的放热反应；在高浓度比下，反应为吸热反应。根据数据推测GMP 与镉离子存在两个结合位点，一个为放热结合位点，一个为吸热结合位点，在低浓度比下，只有放热结合位点发生结合，浓度比达到一定值时，才会激活吸热结合位点，同时发生吸热和放热结合。而且因为吸热结合位点的结合能力更强，反应可能呈现为吸热反应。通过反滴法与正滴法的比较，发现在同一浓度下，不同的滴加方式和滴加顺序也会对结合结果造成较大的影响。

ITC 法作为一种热力学分析方法，可以从得到的热力学参数来解释物质之间亲合力的强弱，是研究物质之间相互作用的黄金标准。本文的研究结果将为筛选可以与镉离子结合的优秀功能单体提供一定的理论数据支撑和实验指导。