运动发酵单胞菌鼓风干燥工艺
2024-02-29姜学权汪浩勇
姜学权，汪浩勇
湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北 武汉 430068
运动发酵单胞菌是一种高效的乙醇生产菌株，有许多理想的工业生物催化剂特性[1]。它的代谢途径已得到广泛研究，有助于揭示其高乙醇生产率和耐受性的机制。
目前，微生物的干燥方法通常包括冷冻干燥、喷雾干燥和真空干燥[2]。相比其他干燥方法，鼓风干燥操作简单，可显著降低成本，同时能达到预期的干燥效果[3]。有研究发现，糖作为干燥保护剂能起到脱水保护的作用，并且不含原基，不会使蛋白质发生褐变反应从而变质失活，甘油可以清除自由基及活性氧，这有助于防止变性和其他形式的损坏[4]。
本研究以运动发酵单胞菌为研究对象，采用固态培养基培养运动发酵单胞菌，使用显微镜计数法统计细菌数量，利用鼓风干燥法处理细菌，通过添加可能的保护剂分析其对细菌存活率的影响，最后采用发酵方式分析鼓风干燥运动发酵单胞菌的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
运动发酵单胞菌由湖北工业大学汪浩勇老师实验室提供。
1.1.2 原料
豆粕和麸皮均购自河北油脂有限公司，含水率分别为11.3%和11.8%。
1.1.3 培养基
固态培养基：豆粕7 g，麸皮3 g，混合后121 ℃灭菌20 min。
ZM 液态培养基：25%葡萄糖，1%酵母提取物，0.1%七水硫酸镁，0.1%磷酸氢二钾，0.1%硫酸铵，pH 6.0～7.0，115 ℃灭菌30 min。
ZM 活化培养基：10%葡萄糖，1%酵母提取物，0.1%七水硫酸镁，0.1%磷酸氢二钾，0.1%硫酸铵，pH 6.0～7.0，115 ℃灭菌30 min。
1.2 仪器与设备
SPX-250-B 型生化培养箱，上海福码公司；LS-335L-I 型高压蒸汽灭菌锅，江阴宾江医疗有限公司；PH50-3A43L 型显微镜，苏州光学神鹰有限公司；101-2B 型电热鼓风干燥箱，恒诺利兴科技有限公司；DHS-10A 型电子水分测定仪，邦西仪器科技有限公司；CJ-2D 型超净工作台，天津泰斯特。
1.3 试验方法
1.3.1 运动发酵单胞菌的固态培养
使用豆粕作为原料提供细菌生长所需的营养，麸皮作为辅料改善培养基的通透性。豆粕与麸皮质量比为7∶3 的混合原料10 g，5%的活化菌液混在无菌水溶液（含有0.1%七水硫酸镁，0.1%磷酸氢二钾，0.1%硫酸铵，5%葡萄糖）中，取10 g 加到混合原料中混匀，在33 ℃恒温培养箱中培养24 h，使用显微镜观察并统计细菌数。
1.3.2 鼓风干燥及保护剂添加
分别用灭菌的淀粉、乳糖和麦芽糖与培养的运动发酵单胞菌固态培养基等质量混合。固态培养基和保护剂各称取4 g（培养基是湿重，含有50.39%的水分），混匀后放在39 ℃电热鼓风干燥箱风吹，直至含水率低于10%。
1.3.3 组合保护剂的选择
培养运动发酵单胞菌的固态培养基与乳糖等质量混匀后，分别添加固态培养基质量分数2%，4%，6%，8%的甘油到其中，另一组分别添加固态培养基质量分数5%，10%，15%，20%的甘露糖，混匀后放在39 ℃电热鼓风干燥箱风吹，直至含水率低于10%。
1.3.4 发酵试验
经过鼓风干燥的菌株用无菌水悬浮起来，以5%的接种量加入葡萄糖发酵培养基，瓶口用活塞塞紧，并添加石蜡油密封，第一次称重并记录，发酵瓶置于恒温摇床中超过72 h。结束后进行第二次称重。
1.3.5 细菌总数及活菌数的确定
运动发酵单胞菌培养结束后，加水约45 g 将细菌悬浮起来，取50 μL 悬液，将其加到有950 μL 无菌水的EP 管中混匀，取10 μL 于血球计数板，用显微镜拍照计数。
鼓风干燥结束后，加入大约45 g 水将细菌悬浮起来，混匀后取10 μL 加到含有30 μL 水的八连管中，取10 μL 亚甲基蓝溶液加入其中进行染色，染色时间大约1 min，取10 μL 染色液于血球计数板上，用显微镜拍照统计细菌总数和活细菌数。其中在显微镜下观察到蓝色的细菌为死细菌，颜色没有变化的是活细菌。细菌数/g=N×256×5 000×稀释倍数（N 为显微镜下观察到的细菌数）
2 结果与分析
2.1 运动发酵单胞菌固态培养
以豆粕7 g 和麸皮3 g 混合作为固态培养基，5%的运动发酵单胞菌与无菌水（含有0.1%七水硫酸镁，0.1%磷酸氢二钾，0.1%硫酸铵，5%葡萄糖）混匀后取10 g 加入固态培养基中，在33 ℃下培养24 h。在显微镜下观察到的形态如图1 所示，运动发酵单胞菌在显微镜下呈圆形、无色透明状态，经统计计算得出细菌数达到1.85×1010CFU/g。表明在此条件下能够培养出足够多的细菌。
图1 运动发酵单胞菌显微镜下的形态
2.2 鼓风干燥的主要保护剂选择
运动发酵单胞菌培养24 h 后，淀粉、麦芽糖、乳糖作为保护剂与培养细菌的固态培养基1∶1 混匀，以不添加任何保护剂的培养基作为对照组，然后放在39 ℃电热鼓风干燥箱中风吹干燥，直到含水量低于10%。麦芽糖和乳糖经过稀释后，可以在显微镜下清楚地观察到细菌，可以作为保护剂与固态培养基1∶1 混匀进行鼓风干燥。麦芽糖和乳糖作为保护剂进行热风干燥后，细菌总数和活菌数分别为1.38×1010CFU/g、7.27×109CFU/g，1.05×1010CFU/g、9.07×109CFU/g。其对应的存活率分别为52.49%和86.34%。对照组总细菌数为7.35×109CFU/g，活菌数只有2.79×109CFU/g，存活率为37.91%。虽然添加麦芽糖后，细菌总数达到最高，但其保护效果不明显，而添加乳糖后，存活率明显比对照组和添加麦芽糖的高，且细菌总数也比对照组有明显增加。因此，选择乳糖作为鼓风干燥的主要保护剂。
2.3 组合保护剂选择
固态培养基等质量的乳糖分别与5%，10%，15%，20%的甘露糖为组合保护剂。当添加5%的甘露糖后，细菌总数达到1.26×1010CFU/g，活菌数也高达1.19×1010CFU/g，细菌数显著比对照组多，其存活率超过94%。进一步增加其添加量，细菌总数明显减少。表明在鼓风干燥过程中，添加5%的甘露糖能有效地增加细菌数，提高细菌存活率。
固态培养基等质量的乳糖分别与2%，4%，6%，8%的甘油作为组合保护剂。添加2%和4%的甘油后进行鼓风干燥，细菌总数分别达到1.38×1010CFU/g 和1.26×1010CFU/g，而活菌数也分别高达1.31×1010CFU/g 和1.2×1010CFU/g，细菌总数明显比对照组多，存活率超过94%。在鼓风干燥过程中，添加一定量的甘油能有效地使细菌从固形物中脱离下来，从而能在显微镜中观察到更多的细菌。当甘油的添加量增加时，细菌数有所减少，过多的甘油添加量也会减少细菌数量。鼓风干燥过程中，2%～4%的甘油添加不仅能有效地提高细菌总数，还能提高细菌干燥存活率。
2.4 发酵试验
鼓风干燥结束后，用无菌水将运动发酵单胞菌悬浮起来，吸取1 mL 接种于25%的葡萄糖发酵培养基中，培养基质量为30 g，用电子天平称整个发酵瓶的质量，在34 ℃下培养72 h，结束后再称其质量，计算其失重。结果如表1 所示，干燥后的失重值为0.100 1 g/g，与没有干燥菌株的失重结果非常接近，表明鼓风干燥方式可用于运动发酵单胞菌的干燥。
表1 发酵失重结果（单位：g）
3 结论
在5%接菌量、5%葡萄糖浓添加量、加水量10 g、33 ℃条件下培养时间24 h，获得的细菌数为1.85×1010CFU/g。在39 ℃下进行鼓风干燥，固态培养基等质量的乳糖与5%的甘露糖作为组合保护剂，活菌数达到1.19×1010CFU/g，存活率超过94%，对鼓风干燥有明显的保护效果。固态培养基等质量的乳糖分别与2%或4%的甘油作为组合保护剂，活菌数分别达到1.31×1010CFU/g 和1.2×1010CFU/g，存活率超过94%。干燥前后的菌株都具有较好的发酵能力。
