对饮用水中疑似铜绿假单胞菌的复核鉴定

田 雨，周鹏飞，吴海平

中轻检验认证有限公司，北京 100016

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）又称绿脓杆菌，为革兰氏阴性杆菌，属于专性需氧非发酵菌类假单胞菌属，广泛分布于自然界的水、土壤、空气中，存在于人和动物的皮肤、肌体、呼吸道和消化道中。当该菌在特定条件下的数量超过人体正常的稳态调节范围时，会引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症和皮肤炎症等疾病，是一种常见的条件致病菌。鉴于铜绿假单胞菌的致病性，我国饮用水标准GB 19298-2014《食品安全国家标准包装饮用水》和饮用矿泉水标准GB 8537-2018《食品安全国家标准饮用天然矿泉水》对铜绿假单胞菌的限量为每250 mL 水样中铜绿假单胞菌不得检出。

目前对饮用水中铜绿假单胞菌的检测，主要使用GB 8538-2022《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》[1]中的滤膜法（以下简称GB 8538-2022 法），即观察CN 琼脂平板上生长的可疑菌落的形态并对其进行生化反应确证，确认该平板上是否存在铜绿假单胞菌阳性菌株。除此之外，一些行业检测标准及研究中还兼用其他检验方法[2-4]来确认菌株是否为铜绿假单胞菌。其中，细菌生化鉴定系统是常见的菌株鉴定手段，其中常用的鉴定系统包括HK-MID 细菌生化鉴定系统和VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定系统[5]。与按细菌生化反应来鉴定其种属的检验方法相比，基因测序更为准确[6]。而在以基因测序的方法鉴定铜绿假单胞菌的研究中，除了选择某段特定基因序列设计的引物进行特异性扩增后再测序外[7]，16S rRNA 基因测序也被广泛运用[8-9]。在以往应用细菌生化鉴定系统和基因测序等众多手段检测铜绿假单胞菌的研究中，大多数研究的重点在于检验方法的准确性与时效性，便于选择更准确、高效的方法来鉴别目标菌株，但对GB 8538-2022 方法在CN 琼脂平板上分离出的非铜绿假单胞菌的细菌没有过多深入研究。本研究对采用GB 8538-2022 法在CN 琼脂平板上生长的10株可疑菌落的菌株进行了检测，同时采用HK-MID细菌生化鉴定系统、VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定系统和16S rRNA 基因测序进行了进一步的鉴定研究，最终以16S rRNA 基因测序的结果作为判定依据，来确认菌株的种属。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用菌株

标准菌株：铜绿假单胞菌ATCC 27853、铜绿假单胞菌CICC 21630，均购自中国工业微生物菌种保藏中心；样品菌株1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 均来自饮用水样品，用GB 8538-2022 法将其从CN 琼脂平板上分离，目前保藏于国家食品监督检验中心微生物实验室。

1.1.2 培养基及试剂

CN 琼脂假单胞菌琼脂基础培养基、绿脓菌素测定用培养基、营养琼脂、乙酰胺肉汤、钠氏试剂、氧化酶试剂，均购自北京陆桥技术股份有限公司；十六烷三甲基溴化铵琼脂、乙酰胺琼脂、SCDLP 液体培养基，均购自青岛海博生物技术有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；16S rRNA 基因通用引物27F （5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’） 和1492R （5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’）：由华大基因合成；PCR 扩增及凝胶电泳所用试剂，均购自北京全式金生物技术有限公司。

1.1.3 仪器及耗材

WFH-203B 三用紫外分析仪产自上海驰唐电子有限公司；HK-MID 细菌生化鉴定系统：配GN A+B 革兰氏阴性杆菌鉴定条产自广东环凯生物科技有限公司；VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定系统：配套革兰氏阴性细菌鉴定卡（VITEK 2 GN卡）以及生理盐水和一次性透明塑料试管均产自法国梅里埃公司；DensiCHEK plus 比浊仪产自法国梅里埃公司；BioDrop uLite 超微量核酸蛋白测定仪产自英国柏点公司；TProfessional Trio PCR 仪产自德国耶拿分析仪器股份公司；JY300C 电泳仪及电泳槽产自北京君意东方电泳设备有限公司；QUANTUMST5 全自动凝胶成像系统产自北京五洲东方科技发展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化

将实验室保藏的标准菌株及样品菌株，分别划线接种于假单胞菌琼脂基础培养基/CN 琼脂、十六烷三甲基溴化铵琼脂和乙酰胺琼脂三种不同的培养基平板上，36 ℃培养48 h。

1.2.2 菌落形态观察

观察三种培养基上的菌落形态，必要时将其置于紫外线下观察，判断菌落是否存在荧光。对于三种培养基上生长的疑似菌落，按照GB 8538-2022 法进行生化反应确证试验。

1.2.3 生化反应确证试验

产氨试验：将CN 琼脂上发荧光、非蓝色且非绿色的菌落，或不发荧光、红褐色菌落纯培养物接种到乙酰胺液体培养基中，接种乙酰胺肉汤，36 ℃培养24 h 后滴加1～2 滴钠氏试剂，10 s 内检查试管的颜色变化，若表现出从黄色到砖红色的颜色变化，则结果为阳性，否则为阴性。

42 ℃生长试验：将CN 琼脂上发荧光、非蓝色且非绿色菌落的纯培养物接种到营养琼脂平板上，42℃培养48 h，能生长的为阳性结果，否则为阴性。

1.2.4 HK-MID 细菌生化鉴定系统

氧化酶试验：取2～3 滴氧化酶试剂于无菌平皿内的洁净滤纸上，用一次性塑料接菌环挑取培养物涂抹在滤纸上，10 s 内显示为深蓝紫色的为阳性反应。

GN A+B 革兰氏阴性杆菌鉴定试剂条进行鉴定：挑取单菌落至营养琼脂平板上，划线分离，36 ℃培养24 h 后，自营养琼脂平板上挑取1 个新鲜菌落至5 mL 无菌0.85%的氯化钠溶液中，混合均匀。将制得的菌悬液滴加至GN A+B 的鉴定试剂条上，36℃培养48 h 后观察并记录相关反应，在Microgen ID软件上读取鉴定结果。

1.2.5 VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定系统

将菌液滴加至HK-MID 细菌生化鉴定系统的同时，再从36 ℃培养24 h 的营养琼脂平板上挑取单菌落，放入含有3 mL0.9%氯化钠溶液的一次性透明塑料试管中，制成浊度为0.48～0.61 的均匀菌悬液。将试管放置在VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定系统的载卡架上，将VITEK 2 GN 卡导管插入菌悬液中。按VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定系统的操作说明书，对测菌悬液进行充填、装载，并在VITEK 2 Systems 软件中进行设定，次日观察鉴定结果。

1.2.6 16S rRNA 基因测序

自营养琼脂平板上挑取1 个新鲜菌落至SCDLP 液体培养基中，36 ℃培养至培养基浑浊。按照细菌基因组DNA 提取试剂盒说明书上的操作步骤，提取标准菌株和样品菌株的DNA。在确认DNA纯度和浓度均符合PCR 扩增要求后，使用16S rRNA 基因通用引物27F 和1492R 对菌株的DNA进行PCR 扩增。PCR 反应体系为：引物27F 和1492R 各1 μL，10×Easy Taq Buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，High Pure dNTP （2.5mM）2 μL，Bovine Serum Albumin 0.3 μL，Easy Taq DNA Polymerase 0.2 μL，DNA 模板2 μL，DNase/RNase-free Deionized water 16 μL，合计总体积25 μL。PCR 反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，该流程共循环30 次；最后72 ℃延伸10 min。扩增完成后，用凝胶电泳检测扩增产物，并将具有16S rRNA 基因片段的目的条带送至华大基因进行基因测序。

2 结果与分析

2.1 标准菌株及样品菌株的菌落形态及初步生化反应确证试验结果

目前标准方法中铜绿假单胞菌的选择性培养基主要为CN 琼脂[1,10]、十六烷三甲基溴化铵琼脂[11-12]和乙酰胺琼脂[11]，如果样品菌株仅能在CN 琼脂上生长，而不能在十六烷三甲基溴化铵琼脂、乙酰胺琼脂培养基上生长，则表明CN 琼脂的选择性较差。对10 个样品菌株及作为阳性对照的2 个铜绿假单胞菌标准菌株的菌落形态进行观察及初步生化确证试验的结果见表1。

表1 标准菌株和样品菌株的菌落形态及初步生化试验结果

由表1 可知，2 个标准菌株和10 个样品菌株均能在三种培养基上生长，说明本试验中CN 琼脂培养基的选择性较好。其中只有2 个标准菌株和样品菌株9、10 的菌落形态符合GB 8538-2022 法中铜绿假单胞菌的特征形态，结合产氨试验和42 ℃生长试验结果，可判定样品菌株9、10 为铜绿假单胞菌，样品菌株1～8 中的疑似菌落为非铜绿假单胞菌。

2.2 标准菌株及样品菌株氧化酶试验结果

按HK-MID 细菌生化鉴定系统说明书的要求，首先对待测菌株进行氧化酶试验以确定使用鉴定试剂条的种类。10 个样品菌株及2 个标准菌株的氧化酶试验结果见表1。由表1 可知，10 个样品菌株及2个标准菌株的氧化酶试验结果均为阳性，因此选择GN A+B 革兰氏阴性杆菌鉴定试剂条进行后续鉴定。

2.3 标准菌株及样品菌株的PCR 产物凝胶电泳结果

为了知晓PCR 产物是否含有目的基因片段，需要先对其进行凝胶电泳测定，10 个样品菌株及2 个标准菌株的PCR 产物凝胶电泳结果见图1。

图1 标准菌株和样品菌株PCR 产物的凝胶电泳图

由图1 可知，样品菌株1～10 及2 个标准菌株的PCR 产物在1 500 bp 处均有清晰明亮的条带，证明已成功扩增出了可用于测序的16S rRNA 基因片段，可进行下一步的基因测序。

2.4 标准菌株及样品菌株的HK-MID 细菌生化鉴定系统、VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定系统及16S rRNA 基因测序的鉴定结果对比

为了确认10 个样品菌株的种属，运用HK-MID细菌生化鉴定系统、VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定系统及16S rRNA 基因测序三种不同的微生物鉴定方法，对样品菌株进行检测，并以标准菌株ATCC 27853 和CICC 21630 为阳性对照。结果见表2。

表2 标准菌株及样品菌株的三种鉴定方法鉴定结果对比

由表2 可知，经过上述三种鉴定方法的检测，标准菌株ATCC 27853、CICC 21630 和样品菌株9、10均被判定为铜绿假单胞菌，且可能性都在90%以上，结果与GB 8538-2022 法的判定结果一致。说明三种鉴定方法均可用于鉴定饮用水中的铜绿假单胞菌。

然而以16S rRNA 基因测序结果作为最终判定依据进行比较后发现，HK-MID 细菌生化鉴定系统将样品菌株1、4～8 共六株菌均被误判为莫拉氏菌属（Moraxella.spp）。同时，将属于恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）的样品菌株2、3 误判为铜绿假单胞菌。造成该现象的原因推测为：广东环凯生物科技有限公司提供的《HK-MID 革兰氏阴性杆菌生化鉴定系统使用说明书》的数据表中，没有代尔夫特菌属（Delftia） 和嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）的相关数据，导致样品菌株1、4～8 被误判为莫拉氏菌属。

与HK-MID 细菌生化鉴定系统相比，梅里埃公司的VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定系统不仅可明确将食酸代尔夫特菌（Delftia acidovorans）、嗜麦芽窄食单胞菌与莫拉氏菌属区分开，还正确鉴定出了样品菌株2、3 为恶臭假单胞菌。对于样品菌株1，VITEK 2 Compact 的鉴定结果为食酸代尔夫特菌（Delftia acidovorans），而16S rRNA 基因测序的结果显示该菌种为Delftia sp. WY8、Delftia lacustris 和Delftia tsuruhatensis，虽然菌种不同，但均为代尔夫特菌属细菌。可见，VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定系统的检测范围更加广泛，鉴定结果也更精准。

2.5 标准菌株及样品菌株的系统发育树

为了更直观地表达上述细菌之间的亲缘关系，首先将2 个标准菌株和10 个样品菌株用16S rDNA的测序结果在NCBI 数据库中进行BLAST 比对，得出了具体的所属菌种。并采用MEGA 软件绘制系统发育树呈现其结果，见图2。

图2 样品菌株（sample）和标准菌株（Pseudomonas putida）的系统发育树

从图2 可以看出，同属铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的标准菌株ATCC 27853、CICC 21630 和样品菌株9、10，与同属恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）的样品菌株2、3 的亲缘关系最近，与同属嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）的样品菌株4～8 的亲缘关系次之，而与代尔夫特菌属（Delftia）样品菌株1 的亲缘关系最远。

3 结论与讨论

从研究结果可知，由于HK-MID 细菌生化鉴定系统中的GN A+B 革兰氏阴性杆菌鉴定条的生化反应孔数量较少、判定信息不足、数据库细菌种类不够全面等，导致该系统的误判几率很大，而VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定系统包含更多详细的生化反应信息和精密仪器，其鉴定结果更加精确，可用来进行最终的菌株判定。同时，VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定系统及16S rRNA 基因测序均可以对疑似菌株进行精确鉴定。

值得注意的是，这些疑似铜绿假单胞菌的菌株中包含食酸代尔夫特菌、恶臭假单胞菌和嗜麦芽窄食单胞菌等细菌。其中，食酸代尔夫特菌可能会使免疫力低下的病患产生伤口感染及多种炎症[13]；恶臭假单胞菌也是条件致病菌[7]，且发生过医院感染的情况[14]；嗜麦芽窄食单胞菌也会引起多种炎症与感染[15-19]，其中最常见的是血液和呼吸道感染[20-23]，这两种感染的发病率和死亡率较高[24-25]。因此，出于对消费者健康和公共卫生安全的考虑，在包装饮用水、矿泉水乃至水源水中，除了铜绿假单胞菌之外，其他条件致病菌（如代尔夫特菌属、恶臭假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌等）也应当受到重视，相关部门适当监督并控制这些细菌的造成污染非常有必要。