MyD88L265P及CD79B基因突变对原发性中枢神经系统淋巴瘤预后的影响

蒋皓云，金祺祺，张丽田，李翠翠，岳宁宁，吴重阳

兰州大学第二医院血液科，甘肃兰州 730030

原发性中枢神经系统淋巴瘤(primary central nervous system lymphoma，PCNSL)是一种罕见的侵袭性结外非霍奇金淋巴瘤，病变局限于脑、脊髓、软脑膜或眼[1‐2]。由于化疗药物难以有效通过血脑屏障，PCNSL 患者治疗效果不佳，且复发率高、预后差[3‐5]。目前PCNSL诊断的金标准仍为组织活检，联合特异性基因突变及脑脊液特征性细胞因子检测可提高诊断的敏感度[6]。多项研究发现，MyD88L265P、CD79B基 因 为PCNSL 热点 突 变[7‐10]，对PCNSL 的诊断、预后及靶向治疗具有潜在临床价值。本研究检测18 例PCNSL 患者肿瘤组织中MyD88L265P、CD79B的突变频率，并回顾性分析其与PCNSL 患者预后的相关性，旨在为PCNSL 的临床诊治提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2018年8月－2020年11月在兰州大学第二医院诊治的18例PCNSL患者作为研究对象。纳入标准：(1)依据2016 年世界卫生组织(WHO)造血和淋巴组织肿瘤分类的诊断标准诊断为PCNSL，且初诊时均有明确的病理学诊断证据；(2)临床检验及病理资料完整；(3)免疫功能正常(无HIV感染史、无免疫抑制药服用病史)；(4)接受以利妥昔单抗(Rituximab，R)、氨甲蝶呤(methotrexate，M)、替莫唑胺(temozolomide，T)/脂质体多柔比星(dorubicin liposomes，D)/阿 糖 胞 苷(cytarabine，A)(R 375 mg/m2d0 ivgtt， M 3.0～3.5 mg/m2d1 ivgtt，T 200 mg/m2d1～d5 po，D 50 mg/m2ivgtt，A 2.0 mg/m2q12 d2～d3 ivgtt)为基础治疗方案，依照患者病情采用上述治疗方案。排除标准：(1)系统性弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B‐cell lymphoma，DLBCL)中枢浸润；(2)既往存在其他恶性肿瘤病史；(3)存在精神性疾病。

1.2 方法 收集PCNSL患者的临床病例资料，并对其临床指标及肿瘤组织中MyD88L265P、CD79B的突变频率与预后的相关性进行回顾性分析。患者生存分析采用Kaplan‐Meier 法。

1.2.1 免疫组化及结果判定 肿瘤组织标本经开颅手术或立体定位活检术获取，经常规组织包埋、切片和染色，并采用Envision二步法进行免疫组织化学染色。本研究所使用的一抗包括：抗CD20、CD79a、CD10、CD23、BCL2、BCL6、MUM1、cyclin D1 及Ki67 抗体(福州迈新公司)。所有免疫组织化学染色结果均由兰州大学第二医院两名具有高级职称的病理科医师判定为阳性或阴性。

1.2.2MYD88L265P及CD79B基因突变检测 分析存档的5～10 µm厚的4%多聚甲醛溶液固定、石蜡包埋脑活检切片，分别采用实时荧光定量PCR、一代基因测序技术对MyD88L265P及CD79B突变进行全外显子检测。采用ABI7500 荧光定量仪(美国赛默飞世尔科技公司)检测MyD88L265P突变，PCR 正义引物5'‐GGGGATGGCTGTTGTTAA‐3'，反义引物5'‐GC‐AGGGGTTGGTGTAGTC‐3'。采用一代基因测序技术检测CD79B突变，采用的PCR 扩增引物序列见表1。PCR 产物经15%琼脂糖凝胶电泳，产物纯化，并用ABI 3730XL测序仪(美国ABI)测序。

表1 PCR法扩增 CD79B基因采用的引物序列Tab.1 Primer sequences for PCR amplification of CD79B

1.2.3 随访 患者无进展生存期(progression‐free survival，PFS)定义为初次诊断至疾病进展、死亡或最后一次随访的时间；总生存期(overall survival，OS)定义为初次诊断至死亡或最后一次随访的时间；随访时间截至2022 年3 月31 日。生存时间以“月”为单位计算，中位随访时间为24.5(16～43)个月。

1.3 统计学处理 采用SPSS 26.0 软件进行统计分析。计数资料以例(%)表示，组间比较采用χ2检验。Kaplan‐Meier 生存曲线之间的差异采用双尾Log‐rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床资料 本组18 例PCNSL 患者发病年龄为52.0(29.0～64.0)岁，其中≥50 岁13 例(占72.2%)。9 例为单发肿瘤，9例为多发肿瘤，其中8例深部脑组织受累(胼胝体、基底节、脑干或小脑)。18 例组织学分型均为DLBCL；按细胞来源分型，8 例为生发中心来源(germinal center B‐cell，GCB)，10例为非GCB。临床表现多样，10例(占55.6%)以头痛、头晕为首发症状，肢体无力11 例(占61.1%)，视物模糊6 例(占33.3%)，意识障碍2例(占11.1%)，言语功能障碍4例(占22.2%)。除1 例两个疗程治疗无效死亡，其余17例均接受至少6个疗程化疗；患者在第4疗程后接受疗效评估，5 例完全缓解(complete response，CR)，4 例 部 分 缓 解(partial response，PR)，8 例 疾 病 进 展(progressive disease，PD)。截 至2022 年3 月31 日，4例死亡(表2)。

表2 18例原发性中枢神经系统淋巴瘤的临床资料Tab.2 Clinical data of 18 patients with primary central nervous system lymphoma

2.2MyD88L265P及CD79B基因突变分析 荧光定量PCR 和一代基因测序技术检测结果显示，18 例PCNSL 组 织MyD88L265P突 变 率 为38.9%(7/18)；CD79B突变率为33.3%(6/18)，其中3 例检测到CD79BY196突变(分别为CD79BY196F、CD79BY196C及CD79BY196S)，另外3例CD79B突变分别为CD79BF172 V、CD79B E197G、CD79B N37H突变；MyD88L265P/CD79B共突变率为27.8%(5/18)，其中CD79B突变位点均不相同， 分别为MyD88L265P/CD79BY196F、MyD88L265P/CD79BY196C、MyD88L265P/CD79BY196S、MyD88L265P/CD79BF172V、MyD88L265P/CD79B N37H。

2.3 PCNSL预后相关影响因素的单因素分析 病灶数量、病灶深部受累及肿瘤组织CD79B突变的PCNSL 患者中位无进展生存期(median PFS，mPFS)差异均有统计学意义(P＜0.05，表3)。Kaplan‐Meier 生存曲线显示，与病灶单发患者比较，病灶多发患者mPFS 更 短(3 个 月vs.未 达 到，P＜0.05，HR=0.226，95%CI 0.046～1.107)，两 者OS 差 异 无 统 计 学 意 义(P＞0.05，图1)；与非深部受累患者比较，病灶深部受 累 患 者mPFS 更 短(3 个 月vs.未 达 到，P＜0.05，HR=0.223，95%CI 0.054～0.919)，OS 差异无统计学意义(P＞0.05，图1)；与野生型患者比较，肿瘤组织中检测到MyD88L265P突变型患者的mPFS 和OS 差异均无统计学意义(P＞0.05)；与野生型患者比较，肿瘤组织中检测到CD79B突变型患者的mPFS 更短(3 个月vs.未 达 到，P＜0.05，HR=0.249，95%CI 0.065～0.952)，OS差异无统计学意义(P＞0.05，图1)。

图1 18例PCNSL患者的病灶数量、病灶深部受累、肿瘤组织CD79B突变与PFS、OS的关系Fig.1 Effects of number of lesions, deep involvement of the lesion, and CD79B mutation in the tumor on PFS and OS in 18 patients with PCNSL

表3 18例PCNSL 患者PFS的相关影响因素Tab.3 Related influencing factors to PFS of 18 patients with PCNSL

2.4 PCNSL 患者PFS 影响因素的Cox 回归分析结果 将单因素分析中差异有统计学意义的影响因素纳入Cox 回归分析，结果显示，病灶深部受累(HR=0.135，95%CI 0.023～0.799，P＜0.05)、肿瘤组织CD79B突变(HR=0.149，95%CI 0.028～0.800，P＜0.05)是PCNSL 患者疾病进展预后不良的独立危险因素(表4)。

2.5MyD88L265P及CD79B基因突变对治疗反应的影响 7 例MyD88L265P基因突变患者的客观缓解率(objective response rate，ORR)为42.9%(3/7)；6例CD79B基因突变患者ORR为33.3%(2/6)。伴发上述两种基因突变的患者中，治疗有效者与无效者的mPFS差异均有统计学意义(P=0.019、P=0.044)，而中位总生存期(mOS)比较差异均无统计学意义(P＞0.05)(表5)。

表5 MyD88L265P 及CD79B 基因突变对13 例PCNSL 患者治疗反应的影响Tab.5 Effects of the mutations of MyD88L265P and CD79B on therapeutic response in 13 patients with PCNSL

3 讨 论

PCNSL 是一种罕见的累及中枢神经系统的非霍奇金淋巴瘤，多继发于免疫功能缺陷患者，但近年来在免疫功能正常患者中的发病率也逐渐升高。PCNSL 疾病进展迅速，早期诊断困难，疾病预后较差。PCNSL 诊断的金标准仍为接受立体定向活检术或开颅手术，行病理学及免疫抗原检测确诊，但手术活检可能存在严重并发症的风险及活检无法触及的病变部位等手术禁忌。目前病损切除的预后意义尚存在争议。对于不能活检的患者，可行脑脊液检查，但其敏感度较低，尚无可替代活检的细胞因子或其他标志物。90%以上的PCNSL 病理表现为DLBCL，其中以非GCB亚型多见[11]。本研究中18例PCNSL 病理表现均为DLBCL，其中56%的患者为非GCB亚型。既往研究发现，非GCB亚型PCNSL预后较GCB 亚型差[11]；本研究中非GCB 亚型的mPFS 与GCB 亚型差异不明显，与既往研究结果不一致，可能与样本量较小有关。

国际结外淋巴瘤研究组织(International Extranodal Lymphoma Study Group，IELSG)提出的PCNSL 预后评分系统，共纳入年龄、ECOG 评分、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)水平、脑脊液蛋白水平、病灶累及脑深部(脑室旁、基底节、脑干、小脑)5个危险因素，目前已在临床广泛应用。本研究18 例PCNSL 初诊评估56%出现深部脑组织受累，脑组织深部受累者mPFS明显短于非深部受累者，且Cox回归分析结果显示脑组织深部受累是预后不良的独立危险因素，与IELSG 评分系统一致。但本研究中PCNSL 患者年龄、ECOG 评分、LDH 水平与预后的相关性不明显，可能与样本量小、随访时间短有关。本研究因部分患者颅内高压未行腰穿或拒绝腰穿，未收集到全部病例的脑脊液相关数据，未进一步行脑脊液分析。本研究中，初诊时PCNSL肿瘤多发者的mPFS 明显短于单发者(3个月vs.未达到)；患者性别及免疫组化BCL2、BCL6、MUM1 是否阳性表达与预后的相关性不明显，可能与样本量较小、随访时间较短有关，有待扩大样本量及延长随访时间进一步观察。

PCNSL 高度依赖于慢性活化的 BCR 信号转导，其 特 点 是MyD88和CD79B基 因 频 繁 突 变[12‐13]。MyD88 是一种重要的衔接蛋白，属于Toll 样受体(Toll‐like receptors，TLR)/白 细 胞 介 素(interleukin，IL)‐1R家族，可介导多种细胞因子受体和TLR、JAK‐STAT、核因子κB(nuclear factor kappa‐B，NF‐κB)等通路的信号转导，上述信号通路的失调诱导激活NF‐κB 复合物[14]，从而促进肿瘤免疫逃逸、肿瘤发生和进展，因此，抑制MyD88蛋白活化是一种潜在的治疗途径。PCNSL 中影响MyD88基因TIR 结构域90%的突变是MyD88L265P[7]。MyD88L265P在其他血液肿瘤中少见[15]，是PCNSL 较好的分子标志，多项研究认为脑脊液MyD88L265P检测是一种潜在的微创诊 断 方 法[6,16‐17]。本 研 究 中PCNSL 肿 瘤 组 织 中MyD88L265P突变率为38.9% (7/18)，与其他研究报道 的 突 变 率(33%～87%) 一 致[18‐20]； 在 检 测 到MyD88L265P突变的7 例中，除1 例在2 个疗程免疫化疗病灶进展死亡外，其余6例均接受至少6个疗程免疫化疗；7例的ORR为42.9%(3/7)；治疗有效患者的mPFS明显长于无效患者(32个月vs.2个月)，但中位生存期差异无统计学意义(32个月vs.17个月)。既往对于PCNSL中MyD88L265P突变的意义存在争议，本研究结果显示肿瘤组织MyD88L265P突变与患者PFS相关不明显，提示PCNSL 的生物学异质性。

已报道的PCNSL 中CD79B突变率为6.7%～83.0%[10,21]，且大多数CD79B突变集中在Y196周围的免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)区域[22‐23]。本研究在33.3%(6/18)PCNSL 患者中检测到CD79B突变，其中3 例为CD79BY196突变，其他3 例分别为CD79B F172V、CD79B E197G、CD79B N37H突变，这在以往有关PCNSL 的基因突变类型中少有报道，提示CD79B突变的复杂性。本研究结果显示，PCNSL 肿瘤组织CD79B突变与患者 PFS 相关，且为预后不良的独立因素；在检测到CD79B突变6 例的ORR 为33.3%(2/6)，其中5例接受了至少6个疗程免疫化疗；治疗无效者的mPFS 明显短于治疗有效者(2 个月vs.30 个月)，但中位生存期差异无统计学意义(17 个月vs.30个月)。

本研究MyD88L265P/CD79B共突变5例PCNSL患者的ORR为20%(1/5)，其中4例接受了至少6个疗程免疫化疗；治疗有效者的mPFS、mOS与无效者比较差异均无统计学意义(40个月vs.2个月，40个月vs.17个月)。单因素分析显示，MyD88L265P/CD79B共突变与PFS 相关不明显，但5 例中，3 例CD79BY196突变的患者均发生疾病进展，因此，MyD88L265P/CD79BY196共突变是否与PCNSL 的不良预后相关，仍需进一步临床验证。虽然MyD88L265P、CD79B常被认为与NF‐κB 通路相关，但这两种分子均与其他通路有广泛交联，对PCNSL 预后的影响及作用机制可能还与下游信号分子的效应总和相关。

本研究中所有PCNSL均以R‐MTX 为基础方案进行治疗，初始治疗方案中不包含放疗。18 例中，16例(88.9%)接受单纯免疫化疗，2例(例5、例13)因病灶进展辅以放疗，这2 例肿瘤组织中均未检测到MyD88L265P、CD79B突变。促进PCNSL患者疾病进展、影响预后的因素较多，本研究的缺陷之一是仅对初诊时肿瘤组织中MyD88L265P、CD79B突变状态进行生存分析，因不同患者疾病状态、颅内压等条件的变化，未能检测初诊时脑脊液MyD88L265P、CD79B突变加以对照，也未能在病程中或疾病进展时再次取肿瘤组织或收集脑脊液动态监测基因突变，疾病进展是否与这两种基因的克隆演变相关尚需进一步观察。

总之，PCNSL 是一种罕见的淋巴瘤，具有侵袭性高、预后差等特点，MyD88L265P、CD79B在肿瘤组织中的高突变率可为PCNSL的靶向治疗提供更有利的依据；肿瘤组织CD79B突变可能是PCNSL的不良预后因素。鉴于本研究样本量较小和随访时间较短，未来应进一步行多中心、大样本量研究以验证MyD88L265P及CD79B突变对 PCNSL的影响。