复方石淋通片质量评价方法研究

米振清，郭 佩

（山东省泰安市食品药品检验检测研究院·山东省泰安市纤维检验所，山东 泰安 271099）

复方石淋通片由广金钱草、石韦、忍冬藤、海金沙、滑石粉配伍加工而成，临床用于治疗膀胱湿热、泌尿系统感染等，对肝胆膀胱湿热证疗效显著［1］。方中君药广金钱草利湿退黄、利尿通淋［2］；石韦清肺泄热利水［3］、忍冬藤清热疏风通络［4］，合为臣药，可助君药排石通淋；佐药海金沙、滑石粉可利水气、排结石、通肾窍［5］，增君药臣药之效。全方共奏清热利湿、通淋排石功效。目前复方石淋通片执行标准为《卫生部药品标准中药成方制剂：第12 册》［1］，无含量测定控制项，马杰等［6］采用高效液相色谱（HPLC）法仅测定了复方石淋通片中绿原酸和夏佛塔苷的含量，但尚未见指纹图谱及多组分定量测定的报道。为了更全面地评价复方石淋通片的质量，本研究中采用了HPLC法建立复方石淋通片的指纹图谱，同时结合多成分含量测定、聚类分析（CA）和主成分分析（PCA），为复方石淋通片的质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；XP505 型分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度为0.01 mg）；KQ-400DE型超声仪（昆山舒美超声仪器有限公司）。

1.2 试药

复方石淋通片10批（广东万年青制药有限公司，批号分别为21070604，21070909，21091017，21091121，21091228，20091118，20091215，22050413，22050522，22050611，编号为S1 - S10）；夏佛塔苷对照品（批号为111912-202204，含量94.9%），异夏佛塔苷对照品（批号为111895-202103，含量93.7%），绿原酸对照品（批号为110753-202119，含量96.3%），咖啡酸对照品（批号为111914-202105，含量96.0%），马钱苷对照品（批号为111520-202107，含量96.3%），芒果苷对照品（批号为111607 - 201704，含量98.1%），均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件［7-8］

色谱柱：WatersSunfireC18柱（200mm×4.6mm，5µm）；流动相：乙腈（A）- 0.17%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～20 min 时19%A，20～39 min 时19%A →41%A，39～60 min 时41%A →62%A）；流速：0.9 mL/ min；检测波长：327 nm（0～20 min，绿原酸、咖啡酸），334 nm（20～39 min，夏佛塔苷、异夏佛塔苷），240 nm（39～60 min，芒果苷、马钱苷）；柱温：35 ℃；进样量：10µL。

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：取夏佛塔苷、异夏佛塔苷、绿原酸、咖啡酸、马钱苷、芒果苷对照品各适量，精密称定，加70%甲醇溶解，定容，制成每1 mL含上述成分0.698 2，0.273 4，0.503 3，0.138 1，0.269 5，0.262 6 mg 的混合对照品贮备液；精密量取5.0 mL，置25 mL容量瓶中，加70%甲醇定容，即得。

供试品溶液：取样品20 片，除去包衣，研匀，称取1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量，超声（功率400 W、频率40 kHz，下同）处理45 min，冷却至室温，再次称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.45µm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：按复方石淋通片的处方和工艺制备分别缺广金钱草、石韦、忍冬藤的单一阴性样品，并按供试品溶液制备方法制得。

2.3 HPLC 指纹图谱建立

2.3.1 方法学考察

精密度试验：取2.2 项下供试品溶液（编号S6）适量，按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，以夏佛塔苷峰为参照峰，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果的RSD分别为0.28%～0.51%和0.93%～1.46%（n=6），表明方法精密度良好。

稳定性试验：取同一份供试品溶液（编号S6）适量，室温下分别于0，4，8，16，20，24 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定，以夏佛塔苷峰为参照峰，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果的RSD分别为0.37%～0.66%（n= 6）和0.82%～1.53%（n= 6），表明供试品溶液室温放置24 h内基本稳定。

重复性试验：取复方石淋通片（编号S6）适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液6 份，按2.1 项下色谱条件进样测定，以夏佛塔苷峰为参照峰，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果的RSD分别为0.54%～0.92%和1.11%～1.88%（n=6），表明方法重复性良好。

2.3.2 指纹图谱建立及相似度评价

将10 批样品的HPLC 图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A 版），生成10批样品HPLC 叠加指纹图谱，详见图1。并以S6图谱为参考图谱，以多点校正自动匹配生成样品HPLC对照指纹图谱，详见图2。共标示出21 个共有峰，10 批样品的HPLC 图谱与对照指纹图谱的相似度分别为0.994，0.991，0.993，0.992，0.995，0.996，0.979，0.990，0.981，0.993，均大于0.970，表明10批样品共有成分基本一致，质量较稳定。

图1 10批样品高效液相色谱叠加指纹图谱Fig.1 HPLC superimposed fingerprint of 10 batches of samples

图2 样品高效液相色谱对照指纹图谱Fig.2 HPLC reference fingerprint of samples

2.3.3 主要特征峰归属

取2.2 项下混合对照品溶液适量，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图（见图3）。与指纹图谱各主要共有峰进行对比，确认出其中6 个共有成分，分别为绿原酸（3 号峰）、咖啡酸（4 号峰）、夏佛塔苷（11 号峰）、异夏佛塔苷（14号峰）、芒果苷（15号峰）、马钱苷（16号峰），选择保留时间居中、色谱峰响应最大的11 号夏佛塔苷色谱峰为参照峰。

图3 混合对照品高效液相色谱图3.Chlorogenic acid 4.Caffeic acid 11.Schaftoside 14.Isoschaftoside 15.Mangiferin 16.LoganinFig.3 HPLC chromatograms of mixed reference

2.4 多指标成分含量测定

2.4.1 方法学考察

系统适用性试验：取2.2项下各溶液适量，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱中，在与混合对照品溶液色谱相应保留时间处有色谱峰，6个待测成分与相邻峰的分离度均大于1.5，理论板数均不低于4 000。详见图3、图4。

图4 供试品和阴性对照品高效液相色谱图3.Chlorogenic acid 4.Caffeic acid 11.Schaftoside 14.Isoschaftoside 15.Mangiferin 16.LoganinA.Test solution B.Negative reference solution lacking Desmodii Styracifolii Herba C.Negative reference solution lacking Pyrrosiae Folium D.Negative reference solution lacking Lonicerae Japonicae CaulisFig.4 HPLC chromatograms of test sample and negative reference

线性关系考察：分别精密吸取2.2项下混合对照品贮备液0.5，1.0，2.0，5.0，7.0，10.0 mL，置同一25 mL容量瓶中，加70%甲醇稀释，定容，得系列混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以质量浓度（X，µg/mL）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表1。

表1 线性关系考察结果（n=6）Tab.1 Results of the linear relation test（n = 6）

精密度试验：吸取2.2 项下混合对照品溶液适量，按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果夏佛塔苷、异夏佛塔苷、绿原酸、咖啡酸、马钱苷和芒果苷峰面积的RSD分别0.95%，1.13%，0.82%，1.24%，1.06%，1.31%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一份供试品溶液（编号S6）适量，分别于室温下放置0，5，10，15，20，24 h时按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果6 种待测成分峰面积的RSD分别为0.77%，1.06%，0.92%，0.84%，1.17%，0.95%（n= 6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内基本稳定。

重复性试验：取样品（编号S6）适量，按2.2 项下方法平行制备6 份供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算待测成分含量。结果6种待测成分平均含量分别为1.636，0.594 7，1.159，0.301 7，0.608 4，0.609 2 mg/ g，RSD分别为0.75%，0.87%，0.95%，1.21%，1.33%，0.85%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（编号S6）6 份，每份约0.5 g，精密称定，精密加入混合对照品溶液（分别含6 种成分0.281 9，0.102 2，0.200 3，0.054 3，0.108 9，0.107 1 mg/mL）3.0 mL，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n = 6）

2.4.2 样品含量测定

取10 批样品各适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，采用外标法计算含量。结果见表3。

表3 样品含量测定结果（mg/g，n=3）Tab.3 Results of the content determination of six components in samples（mg / g，n = 3）

2.5 复方石淋通片质量分析

CA：以21 个共有峰的峰面积为变量，导入SPSS 24.0 统计学软件进行CA。结果欧式平方距离为10 时，10批样品可聚为3类，S1-S3为第Ⅰ类，S4-S7为第Ⅱ类，S8-S10为第Ⅲ类。详见图5。

图5 聚类分析图Fig.5 Results of cluster analysis

PCA：将表3 中的样品含量测定数据导入SPSS 24.0 统计学软件进行PCA。结果见表4、表5 和图6。由表4 可知，前3 个主成分的特征值均大于1，累积方差贡献率为77.864%（＞70%），表明提取前3 个主成分即可评价样品质量。由表5可知，夏佛塔苷、异夏佛塔苷和绿原酸对第一主成分，马钱苷和芒果苷对第二主成分，咖啡酸对第三主成分的影响较大。

表4 特征值和方差贡献率Tab.4 Eigenvalue and variance contribution rates

表5 复方石淋通片中6种成分含量测定的相关性分析Tab.5 Correlation analysis of content determination of six components in Compound Shilintong Tablets

图6 主成分分析碎石图Fig.6 Scree plot of principal component analysis

3 讨论

复方石淋通片中广金钱草、石韦均含有黄酮、酚酸等多类成分，是发挥利尿护肾、抑菌、预防草酸钙结石形成的主要药效成分。其中，广金钱草的有效成分为夏佛塔苷、异夏佛塔苷及绿原酸［9］，石韦中主要有芒果苷、绿原酸［10］。忍冬藤具有抗炎、增强免疫力及防治结石的功效，特征成分环烯醚萜苷类（马钱苷）和有机酸（绿原酸、咖啡酸）［11］在HPLC图谱中清晰可分辨。海金沙及矿物药滑石粉用量较少，在该色谱条件下未发现特征成分峰。广金钱草、石韦、忍冬藤均含有绿原酸。故将夏佛塔苷、异夏佛塔苷、绿原酸、咖啡酸、马钱苷、芒果苷作为复方石淋通片的含量测定指标。

预试验中采用二极管阵列检测器进行全波长（200～400 nm）扫描，发现复方石淋通片中不同成分最大吸收波长差异较大，故为有效区分成分选择了3个波长，并采用波长切换法。在优化梯度洗脱条件时，考察了乙腈-水、甲醇-水作为流动相梯度洗脱的效果，结果色谱图中未能同时检测到6 个目标成分，同时绿原酸、咖啡酸均为有机酸，水相易电离，峰形拖尾严重；流动相中加入磷酸，可抑制其电离且峰形及分离度均较好。遂对磷酸溶液的体积分数不断优化，最终确定采用本研究中确定的流动相。

综上所述，本研究中建立了复方石淋通片HPLC 指纹图谱，通过对主要药效成分夏佛塔苷、异夏佛塔苷、绿原酸、咖啡酸、马钱苷、芒果苷含量的同时测定，建立了该制剂的多指标成分质量控制模式，同时采用CA，PCA 等化学计量学方法对10批复方石淋通片样品质量进行了综合评价。所建立的方法结果准确、重复性好，可用于复方石淋通片的质量评价。