六神曲发酵过程挥发性风味成分的变化及中药组分缺失对其风味的影响

殷 娴，曹 爽，郭慧敏，王家栋，廖永红*

（1.北京工商大学 轻工科学技术学院，北京 100048；2.北京工商大学 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京 100048）

中药发酵具有悠久的历史，中药发酵是在适当的环境条件下，通过微生物的降解和催化作用对药物产品进行发酵，可以改变药物的原有特性，增强或创造新的效果，扩大药物的用途，满足临床用药的需要[1]。我国早在4 000多年前就学会以高粱、大米、小麦和其他谷物为原料，加入糖化酶（大曲、小曲和麸曲），以固态、半固态或液态形式进行酿酒[2]，传统的食品发酵微生物大多是混菌发酵系统，即原来的核心菌体系统在特定的发酵环境（温度、pH值和营养物质等）中经过长期驯化，形成稳定的核心菌群，对混合菌系统的原料转化和风味发展做出贡献，从而使发酵食品具有独特的口感和营养价值[3]。而后在制酒曲的基础上加入不同的药物，经发酵制成药物曲剂。

神曲的制作始于北魏时期，其制作方法在《齐民要术》一书中有描述，此名始载于《药性论》，明代的李时珍在《本草纲目》中记述了神曲名字的由来。六神曲是由赤小豆、苦杏仁、青蒿、苍耳草、辣蓼和面粉按一定比例混匀后发酵而成的曲剂，具有消食化积的功效[4]。传统的六神曲炮制在原料上主要分为鲜品入药和干品入药，高慧[5]对鲜草药和干草药炮制六神曲的工艺进行比较发现，鲜品和干品所制神曲的淀粉酶和蛋白酶活力并无明显差别。由于鲜草药需要煎汤，炮制工艺较为繁琐，且原材料受季节限制，而使用干草药不受季节约束，更符合现代生产要求，因此本试验中采用干草药的炮制工艺进行发酵。

由于六神曲是采用自然条件下的多菌种混合发酵[6]，发酵参数及质量评价缺乏统一量化标准，发酵过程及质量评价主要凭经验，因此气味就成为评判六神曲质量的重要指标之一[7-8]。张红玲等[9]使用新鲜药材进行一步发酵，利用石油醚回流提取发酵前后的六神曲样品，借助气相色谱质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术在发酵前后的六神曲中共检测到36种成分，有7种酸类、16种酯类成分，其他为少量酚类、烷烃和炔烃，发酵后挥发物的种类大量增加，含量增加最多的是亚油酸乙酯、棕榈酸乙酯及油酸乙酯。吴丹等[10]借助顶空气相色谱-质谱联用的分析方法，从炒六神曲中鉴定了7种短链脂肪酸：乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和己酸。

固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）结合GC-MS技术具有运行时间短、样品量小、无萃取溶剂和重现性好等优点[11]。王晖等[12]从白酒窖泥中分离和筛选乳酸菌对高粱培养物进行发酵，并分析产生的挥发性香气化合物。樊倩等[13]通过顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）进行样品前处理，利用HS-SPME结合全二维气相色谱-飞行时间质谱技术分析和比较两种不同酿造工艺老白干香型白酒的挥发性香气和风味成分。本研究采用HS-SPME-GC-MS技术对六神曲发酵期间挥发性风味物质进行测定，并对发酵原料分别缺少青蒿、辣蓼、苍耳草和苦杏仁的六神曲进行风味分析，探究发酵原料对六神曲的挥发性风味物质的影响，为建立六神曲质量评价体系提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

赤小豆、青蒿、辣蓼、苍耳草和苦杏仁：河北省安国市广盛商贸有限公司；中筋面粉：北京古船福兴食品有限公司；邻二氯苯标准品溶液（纯度＞99.8%）：上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

7890 B-5977 A型气相色谱-质谱联用仪、DB-Wax色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国安捷伦公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头：美国SUPELCO公司；FW-100型粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司；HH-1型数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；LRH-250型生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 六神曲的制备

六神曲发酵包含赤小豆粥发酵和固态发酵。

赤小豆粥发酵：将赤小豆磨成粗粉，加入4倍左右的60～80 ℃水，搅拌成粥状，在32 ℃水浴中敞开培养3 d，发酵得赤小豆粥。

固态发酵：取苦杏仁、干辣蓼、干苍耳秧和干青蒿分别粉碎成粗粉，与面粉和上述发酵赤小豆粥混匀，制成握之成团、掷之即散的软材，置于发酵箱中在32 ℃和85%湿度条件下培养3 d，得到六神曲。

固态发酵时，在发酵0 h、24 h、48 h和72 h时取样，编号分别为B_0 h、B_24 h、B_48 h和B_72 h。在原料缺失实验时，缺少青蒿发酵的六神曲在0 h、24 h、48 h和72 h时取样，编号分别为b 0、b 24、b 48和b 72；缺少辣蓼发酵的六神曲在0 h、24 h、48 h和72 h时取样，编号分别为c 0、c 24、c 48和c 72；缺少苍耳草发酵的六神曲在0 h、24 h、48 h和72 h时取样，编号分别为d 0、d 24、d 48和d 72；缺少苦杏仁发酵的六神曲在0 h、24 h、48 h和72 h时取样，编号分别为e 0、e 24、e 48和e 72。所有样本均冻存于-80 ℃冰箱。

1.3.2 挥发性风味物质检测及分析[14-15]

称取1 g样本于20 mL顶空瓶中，在80 ℃条件下进行固相微萃取（50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头），吸附时间40 min，在250 ℃条件下解吸3 min后测定。

气质分析条件：DB-Wax色谱柱，进样口250 ℃，分流比10∶1，载气为高纯氦气（He），流速为1 mL/min；升温程序：40 ℃保持2 min，以6 ℃/min升至200 ℃后，再以15 ℃/min升至300 ℃保持2 min。离子源温度220 ℃，接口温度280 ℃，扫描范围33～500 m/z。

定性、定量方法[16-17]：结合挥发性风味物质的保留时间和美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）标准图谱库进行检索定性。在六神曲发酵样本中加入内标物邻二氯苯溶液（6.46 mg/mL），采用内标法进行定量。

1.3.3 数据处理与分析

采用SPSS 25.0进行数据处理与主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 结果与分析

2.1 六神曲发酵前后的挥发性风味物质变化

由表1可知，在六神曲样本B_0 h、B_24 h、B_48 h、B_72 h中共检测到33种挥发性风味化合物，包括2种酸、6种醇、7种酯、3种醛、11种烃、1种酮和3种其他类化合物，是六神曲风味的重要贡献者。

表1 六神曲发酵过程中挥发性风味化合物的变化Table 1 Changes of volatile flavor compounds of LiuShen-Qu during fermentation

六神曲发酵0 h时可挥发性风味物质以苯甲醛为主，含量为2 157.43 μg/mL。随着发酵的进行，苯甲醛的含量急剧下降，发酵结束时下降到116.15 μg/mL；苯甲醛下降的同时，苯甲醇的含量迅速增加，苯甲醇发酵0 h时含量为160.08 μg/mL，发酵72 h时成为六神曲中的主要风味物质，含量为703.95 μg/mL，比发酵前增加了3.4倍，推测苯甲醛可能在醇脱氢酶的作用下被转化生成苯甲醇[18]。有资料显示原料苦杏仁中含有苦杏仁苷，在苦杏仁苷酶的催化作用下生成野黑樱苷，野黑樱苷在樱叶酶的作用下生成扁桃腈，扁桃腈被扁桃腈裂解酶催化分解生成苯甲醛[19-21]。FU F Q等[19]研究发现，在六神曲的发酵过程中苯甲醛极不稳定，易被微生物降解，并不是六神曲的药效成分。

本试验共鉴定出6种醇，除苯甲醇之外，还检测到正己醇、5-甲基-1-庚醇、（S）-3-乙基-4-甲基戊醇、3-甲基-2-丁醇和苯乙醇。发酵72 h时含量较多的是苯甲醇和苯乙醇。其中苯甲醇作为抗菌剂广泛应用，由于它的镇痛和麻醉特性，经常被用作注射药物的溶剂，如维生素B注射液和盐酸大黄素的溶剂。同时，苯甲醇还可作为软膏或液体的防腐剂，并作为药物合成的重要中间体[22]。在液体型保健食品中均能检测出苯甲醇[23-24]。苯乙醇是一种无色的水溶性液体，有一种令人愉快的气味，可以从各种物种中提取，如玫瑰、桔子花和风笛。传统上也被用作医学上的抑菌剂，在皮肤护理产品的保存方面非常重要[25]。

酸类物质中鉴定出醋酸和丁酸，其中醋酸在发酵期间的含量最多。从发酵1 d开始醋酸含量显著增加，在发酵72 h时含量为252.97 μg/mL，仅次于苯甲醇，相较于发酵0 h增加了约6.8倍。醋酸在骨科手术中的应用越来越多，由于其无菌特性，也被应用于其他领域，如治疗软组织损伤、术后瘢痕，生物膜的清除（髋关节周围）和清理[26]。吴丹等[10]利用顶空气相色谱-质谱联用法从炒神曲中也鉴定出乙酸和丁酸等酸类物质。

酯类物质共鉴定出7种，分别为草酸丁丙酯、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯、苯乙酸甲酯、水杨酸甲酯、邻苯二甲酸丁基己-3-酯和己醇醋酸酯。发酵期间的酯类物质中含量最多的是苯乙酸甲酯，在发酵0 h的六神曲中并未检测到，随着发酵的进行其含量迅速增长，发酵结束时其含量为143.12 μg/mL，仅次于苯甲醇和醋酸。苯乙酸甲酯具有蜂蜜般甜味并稍带麝香香气，可用于日化香精配方和食用香精中。水杨酸甲酯被用于医学，其作用一般是消炎和镇痛；还作为溶剂和中间体用于制造杀虫剂、杀菌剂、香水、涂料、化妆品染料和纤维染色助剂[27]。张红玲[9]在GC-MS结果中也检测出邻苯二甲酸二丁酯，且随着发酵的进行，其含量也逐渐消失。

香豆素类物质含量在六神曲发酵过程中也呈现增加的趋势，香豆素是一类具有α-吡喃酮结构的化合物，具有抗肿瘤、抗菌等活性[28]，在甘草[29]、白芷[30]的化学成分中均可检测到香豆素类物质。

2.2 六神曲挥发性风味物质的主成分分析

2.2.1 挥发性风味物质的主成分特征值分析

对发酵过程中的六神曲挥发性风味物质进行主成分分析，以A、B、C、D分别代表样本B_0 h、B_24 h、B_48 h、B_72 h。利用SPSS 25对数据进行标准化，进行主成分分析，并计算权重。4种样本（B_0 h、B_24 h、B_48 h和B_72 h）中7类挥发性物质的主要成分特征值及贡献率见表2，主成分的特征向量及载荷分析见表3。由表2和表3可知，提取的2个主成分的初始特征值均＞1，累计方差贡献率达99.89%，丢失的信息较少，可反映样本的主要特征信息。第一主成分为84.42%，醇类、酸类、酯类和其他类的载荷系数（0.99、0.99、0.99和0.99）反映了其对第一主成分的贡献大，主要由发酵过程中产生的物质组成。醛类与第一主成分呈负相关（-0.99）。第二主成分为15.47%，酮类的载荷系数（0.97）反映了其对第二主成分的贡献。挥发性风味物质的载荷大则对六神曲评分的影响大，即对风味贡献大。

表2 主成分特征值及方差贡献率Table 2 Eigenvalues and variance contribution rates of principle components

表3 主成分特征向量及载荷分析Table 3 Principal component eigenvector and load analysis

2.2.2 挥发性风味物质的分类模型建立

根据主成分与特征向量之间的关系，由表3可得到2个主成分的表达式：

Y1=-0.41X1+0.10X2+0.41X3+0.41X4+0.41X5+0.39X6+0.41X7

Y2=-0.13X1+0.93X2+0.09X3-0.14X4-0.05X5-0.30X6+0.01X7

式中X1～X7为原变量标准化变换后的标准变量，各系数为各风味物质的特征向量，计算后可得出4个样本各主成分的评分，Y1、Y2两个主成分的各自方差贡献率为权重系数，建立六神曲挥发性风味物质分类评价模型，即Y=0.844 2Y1+0.154 7Y2，经计算可得每种六神曲样本的综合评分Y，结果见表4。

表4 六神曲各主成分评分综合得分Table 4 Each principal component comprehensive score of LiuShen-Qu

由表4可知，A（B_0 h）样本综合得分＜0，B（B_24 h）、C（B_48 h）、D（B_72 h）的综合得分＞0，说明经过六神曲中所有风味物质的PC1、PC2受发酵时间的影响显著。结合六神曲挥发性风味成分的种类及含量可知，D（B_72 h）样本中的醇类、酸类和酯类含量较高，说明醇类、酸类和酯类对六神曲风味的贡献率明显。六神曲PCA主成分载荷图见图1。

图1 六神曲主成分分析载荷图Fig.1 Principal component analysis load chart of LiuShen-Qu

由图1可知，醛类物质与两个主成分均呈现负相关，说明醛类物质在六神曲发酵后期其含量显著降低；醇类、酸类和酯类与第一主成分有较强的正相关，是六神曲发酵后期的关键风味物质。

2.3 原料缺失对六神曲风味的影响

分别缺少青蒿、辣蓼、苍耳草和苦杏仁中的一种材料，进行固态发酵，对发酵期间的四种六神曲进行取样，进行挥发性风味物质的测定。以六神曲发酵作为对照组，探究发酵原料对六神曲风味物质的影响。

由表5可知，发酵原料缺少青蒿的六神曲在发酵期间共检测出27种挥发性风味物质，含有3种酸类、6种酯类、4种醛类、2种醇类、7种烃类、1种酮类和4种其他类风味物质，其中苯甲醛、苯甲醇和丁酸的含量最高。与对照组相比，酸类物质在发酵0 h时增加了正戊酸，随着发酵的进行逐渐消失，酸类物质以丁酸为主，发酵后的含量增加到364.23 μg/mL，醋酸的含量在发酵过程中逐渐上升，但远低于对照组的醋酸含量。酯类物质中的苯乙酸甲酯含量在发酵过程中虽也呈现逐渐增加的趋势，但浓度大大降低。醛类物质中的苯甲醛随着发酵的进行，其含量虽有降低的趋势，但下降幅度远低于对照组，推测青蒿可能对苯甲醛的分解过程存在影响。醇类物质中仅鉴定出4-甲基-1-己醇和苯甲醇，以苯甲醇为主，发酵期间苯甲醇的含量整体低于对照组，推测青蒿对苯甲醇的产生具有一定的促进作用。

表5 发酵原料缺少青蒿的六神曲发酵过程中挥发性风味化合物的变化Table 5 Changes of volatile flavor compounds of LiuShen-Qu with Artemisia annua deficiency during fermentation

由表6可知，发酵原料缺少辣蓼的六神曲在发酵期间共检测出34种风味物质，包含4种酸类、9种酯类、3种醛类、4种醇类、9种烃类、2种酮类和3种其他类风味物质。

表6 发酵原料缺少辣蓼的六神曲样本中鉴定的风味化合物Table 6 Changes of volatile flavor compounds of LiuShen-Qu with Polygonum hydropiper deficiency during fermentation

与对照组相比，酸类物质中增加了正戊酸和邻羟基肉桂酸（邻香豆酸），正戊酸随着发酵的进行而逐渐消失，邻羟基肉桂酸（邻香豆酸）在发酵72 h时出现，其含量为73.68 μg/mL；酸类物质以丁酸为主，随着发酵其含量逐渐增加，发酵72 h时为334.22 μg/mL，仅次于苯甲醛和苯甲醇；醋酸虽呈现逐渐上升的趋势，但含量远低于对照组。酯类物质中最多的是苯乙酸甲酯，发酵72h时其含量为34.88μg/mL，约为对照组的1/4，虽随着发酵含量逐渐升高，但远低于对照组；发酵过程中邻苯二甲酸二丁酯的含量高于对照组，但随着发酵呈现下降的趋势，推测辣蓼可能对邻苯二甲酸二丁酯的产生存在抑制作用。醛类物质中的苯甲醛含量最高，随着发酵过程逐渐降低，发酵72 h时下降了1.9倍，下降速度依然低于对照组。在酮类物质中，发酵0 h检测到26.20 μg/mL的蒿酮，但随着发酵进行逐渐消失。其他类中的香豆素在发酵0 h、24 h和48 h时含量逐渐增加，但在发酵结束时未检测到该物质，推测辣蓼对香豆素的稳定性有关。

由表7可知，发酵原料缺少苍耳草的六神曲在发酵期间共检测出31种挥发性风味物质，包含5种酸类、7种酯类、3种醛类、2种醇类、9种烃类、2种酮类和3种其他类风味物质。

表7 发酵原料缺少苍耳草的六神曲样本中鉴定的风味化合物Table 7 Changes of volatile flavor compounds of LiuShen-Qu with Xanthium sibiricum deficiency during fermentation

与对照组相比，酸类物质中增加了正戊酸、邻羟基肉桂酸（邻香豆酸）和壬酸，正戊酸和壬酸随着发酵的进行逐渐消失；在发酵72 h时增加了邻香豆酸，其含量为78.02 μg/mL；醋酸的含量在发酵过程中逐渐增加，但远低于对照组含量；酸类以丁酸含量最高，发酵72 h时其含量为306.65 μg/mL。酯类物质中邻苯二甲酸二丁酯在发酵72 h时含量最高，发酵期间含量均高于对照组；其次是苯乙酸甲酯，其含量随着发酵过程逐渐增加，发酵72 h时其含量为27.92 μg/mL，约为对照组含量的1/5。醛类物质的种类明显降低，以苯甲醛为主，发酵72 h时其含量为1 000.20 μg/mL，下降速度低于对照组，推测苍耳草与苯甲醛的降解有关。酮类物质中的蒿酮，在发酵0 h时含量为24.92 μg/mL，随着发酵进行逐渐下降至消失。其他类中的香豆素在发酵前期能检测出，但发酵72 h时并未检测到，推测其在发酵后期被分解转化。

由表8可知，发酵原料缺少苦杏仁的六神曲在发酵期间共检测出40种挥发性风味物质，包含6种酸类、6种酯类、6种醛类、3种醇类、14种烃类、2种酮类和3种其他类风味物质。

表8 发酵原料缺少苦杏仁的六神曲样本中鉴定的风味化合物Table 8 Changes of volatile flavor compounds of LiuShen-Qu with bitter apricot kernels deficiency during fermentation

酸类物质中丁酸的含量最高，其质量浓度高于原料缺少青蒿和苍耳草的六神曲；在发酵72 h时检测出了邻香豆酸，其含量为80.42 μg/mL；醋酸的含量随着发酵的进行逐渐增加，其增长幅度远低于对照组，推测苦杏仁对醋酸的产生具有促进作用。

与对照组相比，酯类以邻苯二甲酸二丁酯为主，其含量随着发酵的进行逐渐降低，其次是丁酸丁酯和3-甲基丁酸苯甲酯；未鉴定出对照组中的苯乙酸甲酯，推测苦杏仁促进苯乙酸甲酯的产生。醛类物质中苯甲醛的含量相对较高，在发酵0 h时苯甲醛为101.73 μg/mL，其含量远低于对照组，约为对照组含量的1/21，推测原料苦杏仁与苯甲醛的产生有关。醇类中的苯甲醇在发酵0 h时并未检测到，在发酵期间其含量逐渐增加，但远低于对照组，推测苯甲醇的产生可能与苦杏仁有关，且苯甲醇可能大部分由苯甲醛转化而来。酮类中的蒿酮在发酵0 h时含量为34.30 μg/mL，随着发酵进行逐渐下降至消失。在发酵前期能检测出香豆素，但发酵72 h时消失。

结合原料缺少青蒿、辣蓼、苍耳草和苦杏仁的六神曲发酵的风味分析，当发酵原料缺少青蒿、辣蓼、苍耳草和苦杏仁中的任何一种药材时，丁酸的含量会极大增加，与此同时醋酸的含量出现明显的下降，推测四种原料对六神曲中酸类物质的形成有关；酯类物质中的苯乙酸甲酯的产生可能与四种原料均有关，其中苦杏仁对苯乙酸甲酯的促进作用可能更大；通过苯甲醛和苯甲醇的变化，推测青蒿、辣蓼和苍耳草均可促进苯甲醛到苯甲醇的转化作用，且苦杏仁与苯甲醛的形成密切相关；推测青蒿、辣蓼、苍耳草和苦杏仁均可抑制香豆素的转化分解。

3 结论

本研究利用GC-MS对六神曲的可挥发性风味成分进行分析，结果发现发酵前后的六神曲中挥发性风味物质存在较大的变化。其中发酵0 h以苯甲醛为主要挥发性风味物质，随着发酵的进行，苯甲醇的含量急剧上升。发酵72 h的六神曲以苯甲醇、醋酸和苯乙酸甲酯等为主要的风味物质，丰富的有机酸和醇类物质为六神曲的消食健胃和抗菌性能提供基础。进一步对原料分别缺少青蒿、辣蓼、苍耳草和苦杏仁的六神曲进行风味分析，发现四种药材均对六神曲的风味具有不同程度的影响。

本研究在探究发酵前后六神曲的挥发性风味成分变化的基础上，对其发酵原料对风味的影响进行分析，揭示了六神曲主要的可挥发性风味物质与发酵原料之间的关系，为六神曲的质量控制提供依据。