基于电子鼻和HS-SPME-GC-MS比较不同空间层次浓香型原酒挥发性风味成分

李俣珠，杨康卓，刘志鹏，何张兰，郑 佳*

（宜宾五粮液股份有限公司，四川 宜宾 644000）

中国白酒是世界六大蒸馏酒之一，距今已有2 000多年的发展历史[1-2]。根据其工艺及风味差异共分为12大类型，其中浓香型白酒因其产量高、分布广，深受消费者喜爱，占总消费量的70%以上[3-5]。它由高粱或多种混合粮食为原料，经发酵后蒸馏而成，具有绵柔甘洌、酒香浓郁、入口绵、落口甜、尾净余长的独特风味[6-7]。

“以糟养窖，以窖养糟”是浓香型白酒与其他香型白酒生产工艺的区别之一[8-9]。浓香型白酒的独特风味，是糟醅与窖泥中的微生物共同发酵产生的。由于受到水分和含氧量等多重因素的作用，不同空间层次的糟醅与窖泥，其微生物群落结构及风味物质之间均具有显著差异[10-11]。因此，不同空间层次的浓香型原酒也具有较大的风味特征差异。

电子鼻，是一种模仿人类嗅觉系统以识别气味的设备，可以对样品的整体风味信息进行客观判别并有效区分，具有操作简单，快速的优势，但无法分离、鉴定样品的香气成分[12-13]。而顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）可对挥发性风味物质进行分离、鉴定，具有灵敏度高、抗干扰能力强等优点[14-15]，已广泛应用于白酒等食品挥发性风味成分的研究，王铁儒等[16]利用HS-SPME-GC-MS和电子鼻技术结合主成分分析成功区分了不同酵母混合发酵的猕猴桃酒。

本研究拟采用HS-SPME-GC-MS技术结合电子鼻技术比较不同空间层次的浓香型原酒的挥发性风味物质，利用偏最小二乘法-判别分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）模型确定对不同空间层次原酒分类起关键作用的香气成分，并对电子鼻结果进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和线性判别分析（lin ear discriminant analysis，LDA）。旨在为分层起糟、分层蒸馏、按质并坛等生产工艺技术提供理论支撑，为浓香型原酒品质控制提供新技术。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

不同空间层次的浓香型原酒样品（分别收集了10口不同窖池的上、下层糟醅蒸馏所得浓香型原酒样品，均为对应窖池的混合样。其中，上层为未被黄水覆盖的干糟，下层为发酵后被黄水沁润的湿糟，上层样品编号为1～10，下层样品编号为11～20）：宜宾五粮液股份有限公司。

C7～C30正烷烃标准品、2-乙基己醇、苯甲醛、苯甲酸、丁酸、3-甲基丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、癸酸、己酸甲酯、月桂酸乙酯（均为色谱纯）：美国西格玛奥德里奇生命科学公司；氯化钠（色谱纯）：阿拉丁生化科技股份（上海）有限公司；苯乙醛（色谱纯）：美国赛默飞世尔科技公司；乙酸乙酯、1-丁醇、月桂酸、丁酸乙酯、己酸乙酯（均为色谱纯）：北京百灵威科技有限公司；3-甲基-2-丁醇、4-甲基-2-戊醇、3-甲基丁醇、戊醇、2-庚醇、己醇、苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯丙酸乙酯、对甲酚、壬酸、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、乙酸正丁酯、乙酸异戊酯、戊酸乙酯、异己酸乙酯、丁酸异戊酯、乙酸己酯、己酸丙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、戊酸异戊酯、己酸丁酯、丁酸己酯、辛酸乙酯、己酸异戊酯、己酸戊酯、壬酸乙酯、DL-2-羟基-4-甲基戊酸乙酯、己酸己酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、十一酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕榈酸乙酯、十八酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯、糠醛、丁醛、3-甲基丁醛、己醛、丙酮、2-戊酮、内标物（4-辛醇、戊酸甲酯）（均为色谱纯）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 7890B-5977B气相色谱-质谱联用仪、HP-INNOWax气相毛细管柱（60 m×0.32 mm×0.25 μm）、SPME专用直型衬管：美国安捷伦科技（中国）有限公司；GERSTEL MPSpro多功能全自动样品前处理平台：哲斯泰（上海）贸易有限公司；2 cm 30/50 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头：美国Supelco公司；PEN3便携式电子鼻：德国Air Sense公司；Milli-Q型超纯水仪：美国密里博公司。

1.3 方法

1.3.1 电子鼻测定

根据本课题组前期优化的方法进行电子鼻测定[17]。具体操作流程如下：吸取10 μL酒样注入10 L气体采样袋中，氮气填充，室温平衡5 min后，进行电子鼻测定。电子鼻参数设置如下：气体流量200 mL/min，传感器清洗时间60 s，调零时间5 s，准备时间5 s，数据采集时间60 s。每个样品重复测定5次，取51～54 s响应值用于数据分析。PEN3电子鼻传感器10个探头具体信息见表1。

表1 电子鼻传感器敏感物质Table 1 Sensitive substances of electronic nose sensor

1.3.2 HS-SPME-GC-MS分析

样品前处理：分别向20 mL螺纹顶空瓶中加入100 μL酒样、900 μL饱和食盐水，同时加入10 μL内标混合溶液（4-辛醇、戊酸甲酯，质量浓度均为100 mg/L），涡旋混匀，并使用配备聚四氟乙烯隔垫的螺纹盖密封顶空瓶。

顶空固相微萃取（HS-SPME）条件：每个样品测试前，将DVB/CAR/PDMS萃取头插入老化器中270 ℃老化3 min。将顶空瓶置于60 ℃振荡平衡15 min，平衡结束后将老化的萃取头插入顶空瓶萃取45 min，后取出萃取头插入GC进样口中，并在230 ℃解吸3 min，进行GC-MS分析测定。

气相色谱条件：HP-INNOWax毛细管柱（60 m×0.32 mm×0.5 μm）；进样口温度230 ℃，载气为高纯氦气（He）（纯度＞99.999%），流速1 mL/min，不分流模式；色谱柱升温程序：40℃保持3min，以4℃/min的速度升温至230℃，保持10min。

质谱条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV；接口温度250 ℃；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；扫描模式：scan；质量扫描范围35～350 m/z，溶剂延迟时间为2 min。

定性和定量方法：通过Mass Hunter软件将未知化合物的质谱图与标准谱库美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）20进行对比，筛选匹配指数＞85的化合物，作为初步判断结果；然后根据相同GC升温程序下正构烷烃（C7～C30）标准品的保留时间，结合Kováts保留指数计算未知化合物的保留指数（retention index，RI），根据文献报道的RI值对化合物进行再次鉴定；最后，对比分析标准品出峰时间与未知化合物出峰时间是否一致，最终判断化合物归属。采用内标法根据被测化合物和内标物相应的色谱峰面积之比，计算各物质的含量，其计算公式如下：

式中：Cs为内标物质量浓度，mg/L；Ci为待测物质量浓度，mg/L；Ai和As分别为待测物和内标物的峰面积。

1.3.3 数据处理

采用WinMuster（Version 1.6.2，AIRSENSE ANALYTICS GmbH）软件对原酒数据进行主成分分析（PCA）和线性判别分析（LDA）；通过SIMCA-P 11软件（Umetrics，Umea，Sweden）对不同层次酒样的挥发性化合物进行PLS-DA模型分析。最后，通过Excel 2019和IBM SPSS 22.0进行结果统计分析及表格制作，Origin 8.0软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同层次浓香型原酒的电子鼻分析

原酒样品在PEN3便携式电子鼻上的传感器响应如图1（a）所示，在进样初期G/G0值较低，随着挥发性气体成分在传感器表面不断聚集，G/G0值逐渐增加，而后趋于平缓。为保证试验结果的重复性，选择51～54 s稳态时段的数据进行分析。上下层原酒样品电子鼻传感器响应值雷达图见图1（b）和图1（c），它可以揭示电子鼻各传感器阵列对原酒样品信号响应的整体和个体差异[18]。由图1（b）和图1（c）可知，上下层原酒在电子鼻上的主要响应传感器均为W1W、W5S、W2S、W2W和W1S，其中下层原酒在W5S、W2W和W1S传感器上的相对响应明显高于上层原酒，说明上下层酒样具有相似的风味轮廓，但在具体风味化合物的种类和含量上有一定差异，这些差异可能来源于氮氧化合物、醇类、醛酮类、芳香类以及有机硫化物。

图1 浓香型原酒样品的电子鼻传感器响应曲线（a）及上层（b）、下层（c）香气特征雷达图Fig.1 Electronic nose sensor response curves (a), aroma characteristics radar diagram of upper (b) and bottom(c) layers of original strong-flavor Baijiu samples

电子鼻数据处理中所采用的模式识别算法可以提高其识别精度和工作效率，同时增强系统的抗干扰能力。其中，PCA和LDA最为常用[19]。PCA是将采集的数据进行转换和降维，得出贡献率最大和最主要的成分，将样品按照主成分划分在不同的区域，通过区域之间的距离表示不同样品之间的差异[20]。LDA是将高维的模式样本投影到最佳鉴别矢量空间的典型监督分类算法。通过LDA可以抽取分类信息和压缩特征空间维数，通过样品空间距离的远近判断样品的性质差异大小[21]。

对上下层浓香型原酒的电子鼻传感器响应值进行PCA和LDA，结果见图2。

由图2可知，第1主成分（principalcomponent，PC）PC1的方差贡献率为75.48%，第2主成分（PC2）的方差贡献率为13.58%，PC1和PC2累计方差贡献率达89.06%，说明PC1和PC2可以反映原酒样品中的绝大部分信息。同一层次酒样的数据点聚集性较好，表明样品具有良好的重复性；不同层次的酒样分布区域明显不同，说明上下层酒样的挥发性风味物质差异明显，且可以通过PCA进行有效区分。酒样线性判别（linear discriminant，LD）因子1的方差贡献率为35.59%，酒样LD2的方差贡献率为8.06%，酒样LD1和LD2的累计方差贡献率为43.65%。结果表明，LDA对电子鼻的原始特征数据解释力度欠佳，但大部分样品间无重叠部分，说明大部分样品间香气特征存在差异，可以进行有效区分。综上，采用不同空间层次原酒样品的挥发性风味化合物差异，均可通过PCA和LDA对其进行有效区分，但PCA比LDA更能准确区分原酒的不同空间层次。

2.2 不同层次浓香型原酒挥发性风味化合物的特征分布

利用HS-SPME-GC-MS分析上下层浓香型原酒中挥发性风味化合物，结果见表2。

表2 不同空间层次浓香型原酒样品的主要挥发性风味化合物GC-MS分析结果Table 2 Results of main volatile flavor compounds in original strong-flavor Baijiu samples with different spatial levels analyzed by GC-MS

由表2可知，在上下层浓香型原酒酒样中共鉴定出76种挥发性风味化合物，包括酯类39种、酸类9种、芳香类9种、醇类8种、酮类4种、醛类3种、呋喃类3种及其他类1种。

不同空间层次原酒样品中各类别挥发性风味化合物的总含量结果见图3。由图3可知，下层浓香型原酒中酯类、酸类、缩醛类、有机酸等总含量均显著高于上层浓香型原酒（P＜0.05）。这是因为在糟醅发酵过程中时窖池下层厌氧程度更高，更有利于己酸菌、梭菌等细菌代谢有机酸[24]；这些有机酸对应的酯类化合物如己酸乙酯、丁酸异戊酯、庚酸乙酯、己酸丁酯、丁酸己酯、己酸己酯、己酸戊酯、己酸异戊酯均具有相同的情况；而半挥发性的酯类如月桂酸乙酯、棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯丁二酸二乙酯等物质上下层原酒间差异不明显。除此之外，3-甲基-2-丁醇、4-甲基-2-戊醇、2-庚醇、己醇、2-乙基己醇，乳酸乙酯、DL-2-羟基-4-甲基戊酸乙酯丙酮、2-戊酮、2-己酮等化合物其下层原酒中的含量显著高于上层（P＜0.05）。这可能是因为在重力作用下糟醅发酵时产生的黄水将上层的部分风味化合物带到窖池底部，使得下层糟醅中富集了更高含量的这类物质[22-24]。醛类化合物中己醛在上层原酒中的含量显著高于下层（P＜0.05）；呋喃类与芳香族类化合物的含量在上下层间差异均不显著（P＞0.05）。

图3 不同空间层次浓香型原酒样品中各类别挥发性风味化合物的总含量Fig.3 Total contents of various categories volatile flavor compounds in original strong-flavor Baijiu samples with different spatial levels

2.3 不同空间层次浓香型原酒的挥发性风味化合物的差异性分析

为进一步明确不同空间层次浓香型原酒中的差异风味化合物，根据PLS-DA模型分析有显著差异的化合物，结果见图4。由图4可知，PC1为55.5%，PC2为11.9%，PC1和PC2累计方差贡献率大于65%，说明该模型反映了样品绝大部分的信息，具有较好的解释力度。结果显示，上下层浓香型原酒样品分别分布在PC1轴的左右两边，说明两者的整体风味具有明显的差异，PLS-DA模型可以对不同空间层次的浓香型原酒进行区分。不同窖池的上层酒样较为聚集，而下层酒样较为分散，与电子鼻的LDA结果相吻合，说明下层原酒具有更大的组内差异，其挥发性风味物质组成更为复杂。

图4 不同空间层次浓香型原酒样品中挥发性风味成分偏最小二乘法-判别分析结果Fig.4 Results of partial least squares-discriminant analysis of volatile flavor components in original strong-flavor Baijiu samples with different spatial levels

变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值可以衡量各组分含量对样本分类判别的影响强度和解释能力，表征了分类过程中各个变量的重要性，通常VIP值＞1的变量在不同样本组之间的判别中起着重要作用[25]。通过VIP值筛选出13个关键差异标记物，结果见图5。

图5 不同空间层次浓香型原酒中关键差异风味化合物的变量重要性投影值Fig.5 Variable importance in the projection values of the key difference flavor components in original strong-flavor Baijiu samples with different spatial levels

由图5可知，13个关键差异性风味化合物中酯类4种、酸类4种、酮类3种、醛类1种、醇类1种。可见，酯类和酸类挥发性风味化合物的含量差异可能是造成上下层浓香型原酒整体风味差异的重要原因。按照VIP值大小排名依次为乙酸异戊酯＞乙酸乙酯＞2-己酮＞丙酮＞2-戊酮＞己醛＞丁酸＞庚酸＞戊酸＞3-甲基丁酸＞DL-2-羟基-4-甲基戊酸乙酯＞戊醇＞己酸乙酯，这些关键差异性化合物含量的不同是引起不同空间层次浓香型原酒风味差异的主要因素。

3 结论

本研究采用HS-SPME-GC-MS结合电子鼻技术对不同层次浓香型原酒的挥发性风味化合物进行了比较分析，共检测出76种挥发性风味化合物，其中酯类39种、酸类9种、芳香类9种、醇类8种、酮类4种、醛类3种、呋喃类3种及其他类1种。且下层浓香型原酒中酯类、酸类、缩醛类、有机酸等总含量均显著高于上层浓香型原酒（P＜0.05）。其中，乙酸异戊酯、乙酸乙酯、2-己酮、己醛、丁酸、3-甲基丁酸、己酸乙酯等13种挥发性风味化合物是两者的关键差异风味物质。电子鼻结果与HS-SPME-GC-MS的结果互相映证，可以通过LDA和PLS-DA模型实现浓香原酒中挥发性成分差异的快速有效鉴别。本研究结果可为科学管理浓香型原酒入库，分级储存等生产工艺提供一定的理论支撑，以保障产品质量稳定。