8种发酵型果酒的抗氧化活性和风味物质研究

章 慧，宋林东，张梦璐，刘慧君*

（北京农学院 农业农村部农产品加工与品质控制重点实验室，北京 102206）

发酵型果酒是指以新鲜水果为原料，经破碎、压榨以及微生物发酵酿制而成的低度饮料酒，酒精度一般在7%vol～18%vol[1-2]。近年来，随着人们健康理念的转变，对酒的需求也向果酒转变[3]，果酒酿造的兴起不仅能解决水果产量过剩、销售不畅等问题，还能提高其附加值，增加农民的经济收入[4-5]。此外，这些以各种水果为原料的果酒不仅保留了新鲜水果的自然风味和营养成分，在发酵过程中还生成了多种新的功能性成分，具有促进血液循环、调节新陈代谢、延缓细胞衰老等作用[6]，因而深受广大消费者的喜爱，消费市场前景广阔[7]。

目前，关于果酒的研究主要集中在酿造工艺的优化和酵母菌种的筛选等方面，冉娜等[8]采用正交试验优化龙眼果酒的酿造工艺，获得了最佳的制备工艺条件。周元等[9]从猕猴桃的果皮中分离出酿酒酵母用于酿制猕猴桃酒，能更好地表达猕猴桃果酒的特征香气。但不同品种的原料所含成分差异不同，也会导致果酒的功效指标和风味成分具有显著影响[10-11]。DAVIDOVIC S M等[12]利用红港（Redhaven）桃果酒与不同品种的白葡萄酒进行比较，发现桃果酒中总酚、总黄酮含量和抗氧化活性均显著高于白葡萄酒，并且果酒在发酵过程中产生醇类、酯类、多糖等各种新成分。桑椹酒和干红葡萄酒颜色相似，都含有大量花青素[13-14]，但因为原料不同，其营养物质和风味各有不同。

当今市场上果酒品类众多，商家常常对其“营养保健”功效大肆宣传，但对不同果酒的卖点宣传模糊，不同果酒具体的营养成分、含量及功能性[15]等也缺乏足够的数据支持。

本研究深入研究不同种类果酒的主要功效指标和香气成分，同时进行感官品评分析，为后续不断优化果酒生产工艺，充分利用水果资源、解决果品过剩等问题提供相关基础数据，并为中国果酒企业细化明确营养成分，对果酒质量的提升及新款果酒的开发提供了理论依据，促进果酒产业在新消费时代健康发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山楂酒（SG，9%vol）、荔枝酒（LG，6.5%vol）、草莓酒（CG，8%vol）、百香果酒（BG，8%vol）、抹茶青梅酒（MG，9%vol）、蜜桃酒（TG，14%vol）、青梅酒（QG，6.5%vol）、南果梨酒（NG，8%vol）：市售；总黄酮试剂盒、植物总酚含量检测试剂盒、2,2-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）自 由基清除能力检测试剂盒、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力检测试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；甲醇、2-辛醇、二氯甲烷：美国Sigma Aldrich公司；无水NaCl、Na2HPO4、柠檬酸、偏重硫酸钾：国药集团化学试剂有限公司。本研究所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

T6紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；TGL-20BR高速台式冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；DK-S24电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；6890N-MSD 5975气相色谱-质谱联用（gas chromatographmass spectrometer，GC-MS）仪：美国Agilent公司；57250-U固相萃取装置：美国Supelco公司；N-EVAP氮吹仪：上海安谱科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 福林酚法测定总酚含量

将5 mg/L没食子酸标准溶液用蒸馏水稀释使质量浓度为0.156 3 mg/L、0.078 1 mg/L、0.039 0 mg/L、0.020 0 mg/L、0.010 0 mg/L、0.005 0 mg/L、0.002 5 mg/L的标准系列溶液，以没食子酸质量浓度（c）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标，得出线性回归方程为：A=1.197c+0.003 6（R2=0.997 3）。吸取50 μL酒样溶液，以蒸馏水稀释的上清液为对照、蒸馏水为空白对照，按照试剂盒方法进行操作，平行3次。

1.3.2 硝酸铝显色法测定总黄酮含量

将1 mg/L芦丁标准品溶液用体积分数60%的乙醇稀释使质量浓度为0、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L、1.0 mg/L的标准系列溶液，以标准品质量浓度（c）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标，得出线性回归为A=2.549 7c-0.004 1（R2=0.998 3）。吸取200 μL酒样溶液，以蒸馏水为空白对照，按照试剂盒方法进行操作，平行3次。

1.3.3 ABTS+自由基清除能力的测定

将10 mmol/L维生素C溶液用试剂盒提取液稀释为0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L的标准系列溶液，以维生素C溶液浓度（c）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标，得出线性回归方程为：A=-0.363 7c+0.348 4（R2=0.975 9）。吸取100 μL酒样溶液，同时以1 mmol/L维生素C溶液为阳性对照、以试剂一稀释的酒样上清液为对照、以蒸馏水为空白对照，按照试剂盒方法进行操作，平行3次。

1.3.4 DPPH自由基清除能力的测定

吸取100 μL酒样溶液，同时以10 mg/mL维生素C溶液为阳性对照、以无水乙醇稀释的酒样上清液为对照、以提取液为空白对照，按照试剂盒方法进行操作，平行3次。

1.3.5 挥发性风味成分分析

根据李媛媛等[16]的方法略作修改。

样品前处理：取10 mL不同品种的酒样（用去离子水稀释）放入20 mL顶空瓶中，加入3 g NaCl和10 μL 500 mg/L的2-辛醇作为内标，充入氮气（N2），密封混匀，同时置于50 ℃恒温加热磁力搅拌器中萃取45 min。在GC进样口，250 ℃热解吸5 min。

气相色谱条件：初始温度50 ℃，保持2 min，然后以2 ℃/min的速度升温至85 ℃保持0.1 min，再以5 ℃/min的速度升温至230 ℃保持2 min。载气为高纯氦气，流速1 mL/min，进样量1 mL，不分流进样。

质谱条件：离子源温度为230 ℃，电离方式为电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量为70 eV，四级杆温度为150 ℃，质量扫描范围为20～350 u。

定性定量分析：对酒样中的化合物的定性主要采用保留指数对比和质谱库检索对比两种方式。将自动识别的色谱峰与美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）08质谱库进行对比，手动筛选出与未知化合物的保留时间与标准样品的保留时间在5 s以内，则认为是同一种物质。风味成分采用内标法半定量分析，挥发性物质含量计算公式如下：

1.3.6 感官分析

参考尹延顺等[17]的方法。

1.3.7 数据处理

使用IBM SPSS Statistics 22.0对试验结果进行单因素方差分析（anaylsis of variance，ANOVA），P＜0.05表示差异显著，The Unscrambler X 10.4进行偏最小二乘回归法（par tial least squares regression，PLSR）分析。

2 结果分析

2.1 不同酒样中总酚、总黄酮含量测定结果

酚类和黄酮类物质是果酒的主要抗氧化成分[18]，果酒抗氧化能力的差异主要由酚类和黄酮类物质的组成与含量及其之间的协同作用造成[19]。

酚类物质是果酒的“骨架成分”，影响着果酒的色泽、香气，具有抑菌、抗氧化、清除自由基、消除疲劳等多种功效。由图1可知，8种酒样中均含有一定量的总酚，含量由高到低为：QG（0.139 mg/L）＞NG（0.092 mg/L）＞SG（0.070 mg/L）＞CG（0.063 mg/L）＞BG（0.056 mg/L）＞MG（0.055 mg/L）＞TG（0.042 mg/L）＞LG（0.031 mg/L），其中QG的总酚含量显著高于其他果酒（P＜0.05），其次是NG。原料水果本身含有多种酚类物质，且在酿造过程中不会破坏酚类化合物在最终产品中的保留。夏道宗[20]研究发现，青梅梅果和梅核中富含大量的总酚物质，赵国群等[21]也发现，南果梨是极适合酿制果酒的梨种，其所酿果酒中总酚含量可达547.20 mg/L。

图1 不同果酒样品的总酚含量Fig.1 Total phenols content of different fruit wine samples

黄酮类物质具有清除氧自由基、延缓细胞衰老、改善心脑血管疾病等功效[22]，也是果酒重要的品质指标。由图2可知，NG（0.02 mg/L）中总黄酮含量显著高于其他7种果酒（P＜0.05），呈现出良好的果酒品质特性。赵一凡[23]的研究也表明南果梨极适合酿制梨酒，其所酿制的果酒中黄酮含量可达311.90 mg/L。

图2 不同果酒样品的总黄酮含量Fig.2 Total flavonoids content of different fruit wine samples

受果实产地差异、果酒工艺设计不同、以及微生物和环境的协同作用等影响，酚类活性物质可能会发生水解、氧化、缩合等[24]，使得总黄酮和总酚含量多寡呈现一定程度的差异。一般认为果酒中酚类物质越多，品质越高。研究发现[25-27]，延长浸泡的时间、缩短酿酒的时间、原料进行复配等均可以帮助提高果酒中酚类和黄酮类物质的含量。

2.2 不同酒样的抗氧化能力

ABTS+自由基目前已被广泛应用于生物样品的总氧化能力的测定[28]。李蜜月等[29-31]的研究结果发现，果酒有较强的ABTS+自由基清除能力。但根据表1的实验结果显示，除了NG具有一定的ABTS+自由基清除能力，清除率为0.9%，其余7种果酒均未检测出ABTS+自由基清除率。原因一方面可能是果酒中的多糖碳链的组成方式和糖基结构的复杂性将抑制果酒的清除自由基能力，导致多糖含量与ABTS+自由基的清除率呈负相关[32]，另一方面可能与果酒的成分、工艺生产流程等有关[33]。本次实验结果中NG的总黄酮含量最高，且呈现一定的ABTS+自由基清除能力。但其他果酒的实验数据来看，与邹晓庆[34]的研究呈现一致，果酒中的总酚含量与ABTS+自由基清除能力不相关。

表1 不同果酒样品的ABTS+自由基清除率Table 1 ABTS+radical scavenging rate of different fruit wine samples

DPPH是一种很稳定的氮中心的自由基，可以捕获其他自由基，常被用于抗氧化性的测定[35]。由图3可知，8种果酒均存在一定的DPPH自由基清除能力，且SG（17.4%）的DPPH自由基清除率显著高于其他果酒（P＜0.05）。研究发现[36]，发酵可使果实中的活性成分更好地溶出，发酵型果酒的DPPH自由基清除率均高于浸泡型果酒，表明发酵果酒抗氧化能力明显优于浸泡型果酒。

图3 不同果酒样品的DPPH自由基清除率Fig.3 DPPH radical scavenging rate of different fruit wine samples

分析总酚、总黄酮与DPPH自由基清除率之间的关系，结果见图4。由图4可知，总酚含量＜0.05 mg/L、总黄酮含量＜0.02 mg/L时，DPPH自由基清除率在0～20%之间轻微跳动；总酚含量在0.05～0.10 mg/L范围内、总黄酮含量在0.02～0.17 mg/L范围内时，随着果酒中酚类物质含量的增加DPPH自由基清除率呈上升趋势；当总酚含量＞0.10 mg/L时、总黄酮含量＞0.17 mg/L时，DPPH自由基清除率减小到10%左右。本次实验果酒中总酚和总黄酮含量与DPPH自由基清除率均无显著相关性（P＞0.05），这可能是因为DPPH自由基清除率是果酒中多种活性因子相互作用的结果，也可能是果酒配制时酚类物质间相互作用发生聚合或解离等复杂反应，这些反应与果实浸渍程度、配制温度、作用时间等多种因素有关[37]，因此果酒中的总酚和总黄酮对自由基清除能力存在一定程度的差异。

图4 总酚（a）、总黄酮（b）含量与DPPH自由基清除率的相关性分析Fig.4 Correlation analysis of total phenols (a) and total flavonoids (b)contents with DPPH radical scavenging rate

2.3 不同酒样中挥发性风味成分分析

采用HS-SPME-GC-MS技术对不同果酒挥发性风味物质进行分析，结果见表2。

表2 不同果酒样品中挥发性风味物质GC-MS分析结果Table 2 Results of volatile flavor substances in different fruit wine samples analyzed by GC-MS

由表2可知，8种果酒样品中共鉴定出挥发性物质种类为132种，酯类40种、醇类22种、羧酸类6种、醛酮类17种、烷烃类29种及其他类18种。其中，检出酯类物质最多，占所有挥发物质种类的33.54%，酯类物质是构成果酒香气的重要物质，许多酯类化合物形成于发酵阶段，赋予了果酒果香，对果酒的总体香气形成具有重要作用。周文杰等[38-39]分别在新疆库尔勒香梨酒和玫瑰香橙果酒中鉴定出酯类物质种类最多。由表2亦可知，CG、MG、SG和TG中的酯类物质含量占比较高，其中CG中独有的2-甲基丁酸乙酯，呈现一种苹果的香味，SG中的肉豆蔻酸异丙酯呈现椰子香味，TG中特有的γ-辛内酯呈现原料桃的甜果香气，并且在8种果酒中，QG中酯类、醇类、醛酮类、羧酸类和烷烃类物质均高于其他品种果酒，可能由于不同原料、酿造技术、菌种等对果酒风味都有影响，研究发现青梅原料低糖且酚类活性物质含量高，且含有110种主要挥发性化合物[40]。

醇类是原水果中的糖和氨基酸经过糖代谢和脱羧、脱氢产生的[41]。适量的醇类可以使果酒产生特殊的香味且散发香气，8种果酒中共有最多的4种醇是仲辛醇、L-2-辛醇、D-2-辛醇和乙醇，平均含量分别为0.57 mg/L、0.30 mg/L、1.64 mg/L和18.69 mg/L。其中，LG、NG和QG检出乙醇含量最高，可能由于它们的酒精度高，但乙醇除了与果酒的酒精度有关外，还能赋予果酒甜香的风味特征[42]。

大多数醛酮类物质主要源于水果发酵、加工和陈酿过程[43]，由表2可知，BG中醛酮类物质比其他类化合物检出含量高，其中5-羟甲基糠醛含量最高，为6.132 mg/L，其赋予果酒春黄菊花的气味。8种果酒中共有的醛酮类物质最多的是桃醛，其具有强烈的桃子香气和杏仁香味。具有独特香气的醛酮类物质的存在是造成果酒风味不同的原因，例如仅在MG中检测到的茉莉酮，散发优雅的茉莉花香和芹菜籽香气，SG中的癸醛，具有玫瑰花和李子香气，LG中的异薄荷酮却呈现一股薄荷香气。其他挥发性风味物质中在8种不同果酒中均存在一定差异，单一物质的检出，往往是水果在未发酵前本身所具有的，也是该种果酒具有独特风味的原因所在。

2.4 不同酒样中关键香气成分分析

果酒中挥发性香气成分的风味强度取决于化合物的浓度和香气阈值，当气味活性值（odor activity value，OAV）＞1时，则认为是香气的主要贡献者，是关键香气成分。不同果酒中OAV＞1的挥发性香气化合物结果见表3。

表3 不同果酒样品中香气活性值＞1的挥发性香气化合物Table 3 Volatile aroma compounds with odor activity value more than 1 in different fruit wine samples

8种果酒中OAV＞1的化合物共有10种，NUZZI M等[44]研究发现，OAV与挥发性强度直接相关。由表3可知，8种果酒中OAV＞1的主要有酯类、醛酮类、醇类和羧酸类化合物，这些物质是果酒活性香气的主要来源，影响果酒整体风味的关键挥发性风味物质，并且各果酒中酯类物质的占比较高，浓度较低时赋予果酒植物香、花香和脂香等香气，使酒样具有独特香味。例如仅在CG中检测到的己酸乙酯，赋予草莓酒果香的气味，MG中的香茅醇和苯甲酸乙酯的OAV显著高于其他酒样，呈现独特的玫瑰和蜂蜜香气，大马士酮仅在SG和TG中检测出，OAV显著高于其他化合物，呈现强烈的玫瑰花香及李子、圆柚的香气。

2.5 不同酒样的感官分析

对8种果酒进行感官评价，如图5所示，8种果酒的感官指标评分各有差异，其中BG、CG、QG、SG、LG、MG和TG分别具有浓郁的花香、果香和甜味，CG、LG、NG和TG具有较强的乳酸味；NG和QG具有麦芽香气；BG、CG、QG、TG、MG和TG分别具有轻微的酸味和苦味。

图5 不同果酒样品感官特性雷达图Fig.5 Radar map of sensory characteristics of different fruit wine samples

2.6 感官特性与化学成分的相关性分析

利用偏最小二乘法（PLSR）分析感官特性和挥发性化合物之间的关系，结果如图6所示。图6-a中，19%的X方差（挥发性物质）和22%的Y方差（感官属性和酒样）可以在PLSR模型中得到解释，图6-b展示了相关载荷图。

图6 果酒香气成分和感官特性的偏最小二乘回归分析结果Fig.6 Partial least squares regression analysis result of aroma components and sensory characteristics of fruit wine

牛云蔚等[45]通过PLSR对不同产地樱桃酒中特征呈味物质与感官属性之间的相关性进行研究，结果表明感官属性与部分特征呈味物质显著相关。由图6可知，TG和CG位于PC-1和PC-2正值处，它的特征是具有果香的感官特性，与感官评价结果相似，果香的气味描述与己酸乙酯和辛酸乙酯等挥发性化合物有关，而且这两种化合物都具有浓郁的果香特征。BG、MG和LG位于PC-1 和PC-2负值处，它的特征是具有甜味等感官特性，并与苯甲酸乙酯和香茅醇等挥发性化合物有关。然而QG的感官描述与挥发性化合物之间的相关性较弱，可能是受复杂成分的影响，有待进一步研究。

3 结论

本研究检测了8种果酒的抗氧化活性，其中，果酒的多酚物质是判断果酒存在差异性的主要原因之一，赋予果酒的颜色、口感和收敛性等感官特性，影响果酒的贮藏稳定性。青梅梅果和梅核中富含大量的总酚物质使青梅酒的总酚含量位于前列，因此选择适宜酿造果酒的优良品种，对果酒产品的品质尤为重要，这为果酒的品种选择优化了方向。抗氧化性依赖于总酚含量，是果酒功能性的主要表现，本研究中8种果酒的抗氧化能力较低，可能由于果酒中多糖结构抑制其清除自由基能力。而这研究结果与商家大力宣传的优良抗氧化功效并不契合，与消费者期望的优质果酒仍有较大差异。

此外，通过感官评价和HS-SPME-GC-MS技术检测不同原料果酒的挥发性风味物质，可清晰看出不同果酒间的共性与差异，这些物质通常可直接或间接赋予果酒特别的果香，对总体香气形成具有重要作用，根据PLSR分析得出果香味与己酸乙酯和辛酸乙酯相关，甜味与苯甲酸乙酯和香茅醇相关。这也为明确不同果酒的含量、功能性以及为消费者甄选果酒类型、品质评价提供了参考依据。

随着人们对果酒的质量提出了更高要求，兼备高营养价值和美好风味的果酒才能受到消费者的青睐，本研究旨在为不同原料的果酒提供丰富的基础数据，推动果酒生产和消费产业革新，从理论层面为我国果酒产业发展和果酒品质深入研究提供参考依据，从而进一步拓展果品资源的利用领域。