应用天然水凝胶修复关节软骨损伤的研究进展*

薛春宇 陈国強 袁俊虎 傅煊健 陈雨航 陈贤艺 关宏业 陈扬

对临床医师来讲，软骨缺损的再生是一项巨大的挑战。据报道，在膝关节镜检查中，有60%的关节炎患者患有软骨损伤，其中15%的60 岁以上的患者患有严重的软骨损伤[1]。与其他大多数组织不同，软骨基本上是没有血管的，且细胞含量少，这会极大地限制受损软骨自愈的能力[2]。当前软骨组织修复策略在临床上已有应用，如微骨折术、自体软骨细胞植入、自体骨软骨移植和同种异体骨软骨移植等，但这些仍然存在明显的局限和不足，包括烦琐的离体细胞操作，潜在罹患肿瘤的可能，治疗风险和监管问题。因此，找寻一种有望解决上述问题的修复软骨的方法具有重要的临床意义。

如今，由支架、细胞和生长因子组成的组织工程材料已经发展成为软骨组织修复最有前景的治疗策略。为了较好地修复软骨损伤，必须制备具有生物降解能力的支架，能模拟特定组织的特征，并能提供细胞或生长因子，为新形成的组织提供支撑。在理想情况下，软骨修复材料应具有无毒无害、多孔性、生物相容性和生物降解能力，且有细胞分化和组织生成能力，从而使得材料具有良好性能，如降解的速度能与新组织形成的速度相匹配，能输送营养物质和代谢物，可与周围天然组织紧密融合粘连和填充受损部位等[3]。

水凝胶是由天然或合成的亲水性聚合物相互交联组成的具有独特的3D交联聚合物网络，该网络可包含诸多化学组分，其物理性质通过材料整体表现出来。构成水凝胶的聚合物链的亲水性能使其吸收一定量的水，可用于生物材料中，以实现药物输送和组织再生。基于交联方式，水凝胶分为化学和物理网络凝胶。化学交联的水凝胶通常通过合成聚合物的分子键结合在一起，并具有稳定、组成相同和结构可控的特点。虽然物理交联的水凝胶通常通过诸如分子缠绕、氢键、离子键或疏水相互作用等次级相互作用聚集，其所形成的结构可逆，具有自我修复的特性，与化学交联水凝胶相比具有多种优势，如易于制造、毒性较小、可重塑和更易生物降解等[4]。

1 天然水凝胶在软骨损伤中的应用

天然水凝胶由于具有生物相容性、可降解性和与细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的相似性，在组织再生中具有明确的应用，可令细胞具有生物活性，能提供良好的黏附表面。用于水凝胶制备的天然聚合物，包括蛋白质基材料（如明胶、胶原蛋白、纤维蛋白和丝蛋白）和多糖基材料（如透明质酸、硫酸软骨素、藻酸盐和壳聚糖等）。天然水凝胶无毒、不能引起免疫反应，并且其降解产物也是无毒和无免疫原性的，最终代谢产物会安全地排泄到体外。但是，天然水凝胶的稳定性差，降解快及机械强度相对较低，极大地限制了其应用[5]。

1.1 海藻酸盐水凝胶

海藻酸盐（alginate, ALG）是从褐藻中提取的天然多糖，β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronic, M）和α-L-古洛糖醛酸（α-L-guluronic, G）按（1→4）键连接而成，由于其良好的生物相容性、高水化粘弹性、交联能力和物理特性，已被广泛用于封装细胞[6-7]。与其他天然聚合物相比，海藻酸盐有利于细胞行使功能和细胞锚定，形成3D多孔水凝胶支架[8]。海藻酸盐水凝胶可以支持软骨细胞的生长和增殖，并维持其形态。Kosik-kozioł 等[9]发现体外培养后14 d，约80%的人软骨细胞保留在水凝胶支架中，且软骨细胞在整个培养过程中保持圆形。另外，海藻酸盐水凝胶还能转移间充质干细胞进行软骨再生。通过海藻酸盐水凝胶和烧结的聚乳酸－乙醇酸微球支架复合，在这种条件下，这些软骨细胞可以从软骨层向软骨下骨层转移，实现界面的整合，该材料在兔膝关节缺陷模型中表现出优异的组织修复效果[10]。

然而，海藻酸盐水凝胶的应用仍然存在一些限制。首先，海藻酸盐水凝胶的稳定性较差，即使在生理环境下也会在短时间内逐渐丧失机械强度，这则需要设计交联过程来增强机械性能[11]。其次，由于海藻酸盐在哺乳动物中的细胞黏附力和与细胞相互作用的能力都较低，所以需引入细胞黏附物质，以更好地支持细胞功能。在精氨酸/甘氨酸/天冬氨酸功能化海藻酸盐水凝胶中嵌入骨髓来源的间充质干细胞可以增强骨软骨再生并提高修复后组织的机械性能[12]。然而，海藻酸盐水凝胶的机械性能较差，限制了其在医学中的应用潜力。有研究将细菌纤维素引入双网络水凝胶系统中来制备高性能的生物水凝胶。该水凝胶压缩模量与天然关节软骨相匹配，但其溶胀度明显下降，在兔的骨软骨缺损模型的结果证明了该双层结构支架良好的骨软骨修复效果[13]。另外，以海藻酸盐－聚甲基丙烯酸酯杂化水凝胶为骨架，在静电和共价相互作用的基础上，通过交联形成单一的多孔结构来制备支架材料克服了单纯海藻酸盐材料的机械性能限制。海藻酸盐提供了模拟细胞外基质的合适微环境，而甲基丙烯酸酯部分也可以改善所得混合水凝胶的机械性能[14]。

1.2 壳聚糖水凝胶

壳聚糖来源于几丁质，是一种源自甲壳动物壳的阳离子聚合物，具有良好的亲水性、生物相容性和生物降解性，是结缔组织的重要组成部分，具有络合、抑菌、吸附和抗氧化的作用[15-17]。壳聚糖可以在酸性pH或非溶剂条件下凝胶，可进一步制备基于壳聚糖的水凝胶支架。壳聚糖具有良好的生物相容性和可降解性。因而，它是一种具有广泛应用前景的组织工程材料，可以认为是医学领域软骨修复的潜在材料。尽管壳聚糖与其他天然聚合物的混合物可以通过静电相互作用生成一系列功能性水凝胶，但其物理交联的网络极易溶解，力学性能较弱，极大地限制了其应用[18]。同时为了克服其不溶于水的缺陷，有研究制备了具有良好溶解性的N-琥珀酰壳聚糖-二醛淀粉混合物水凝胶，以修复软骨缺损[19]。壳聚糖的致敏性和作用机理也可能需要在其临床应用中加以改进。与单纯壳聚糖水凝胶相比，引入聚己内酯支架后，复合支架的压缩模量显著增加，该复合支架有益于细胞存活。因此，复合水凝胶支架往往具有令人满意的机械强度和仿生微环境。

1.3 明胶水凝胶

明胶是一种水溶性蛋白，是胶原蛋白部分水解而来的产物，由一系列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列组成，具有良好的生物相容性、降解性和温敏性，其最高临界溶解温度在25 ～ 35℃，可改善细胞黏附和基质金属蛋白酶的能力。基于明胶的复合物已被用作生物材料领域中用于组织工程和分子载体的合适支架。然而，单纯明胶水凝胶存在热稳定性差与力学稳定性差等问题。因此，有必要对明胶结构进行一定程度上的化学改性，以提高明胶水凝胶的理化性能，使其更适合在软骨修复应用。通过甲基丙烯酸酐修饰明胶来获得甲基丙烯酰胺化明胶（gelatin methacryloyl,GelMA）是一种常见且有效的明胶改性方式[20]。研究发现，紫外光照交联时间1 min 时GelMA 水凝胶的吸水速率和平衡溶胀比最佳，降解速度快，拉伸性能与天然软骨结构类似，具有良好的生物相容性，与骨修复材料力学匹配[21]。将明胶进行化学修饰以制备生物支架，为骨关节炎软骨损伤的治疗提供了新思路。

1.4 胶原水凝胶

胶原蛋白是细胞外基质的重要成分，是一种天然的生物材料，主要为Ⅰ型与Ⅱ型胶原蛋白，为三螺旋结构，广泛存在于皮肤、骨骼、软骨、血管、牙齿和肌腱中，已广泛应用于生物和医学领域。胶原蛋白水凝胶可通过紫外光照聚合，脱氢热处理或与其他基团发生交联反应制备。Calabrese等[22]评估了一种新型支架，该支架由Ⅰ型胶原蛋白和人脂肪来源的间充质干细胞组成，具有良好的成软骨潜能，无论是否存在软骨诱导因子，该支架都具有较高的软骨再生能力。体内和体外实验表明，含有软骨细胞的Ⅱ型胶原水凝胶支持间充质干细胞的增殖和软骨生成[23]。并且，由Ⅰ型和Ⅱ型胶原蛋白制备的复合水凝胶可通过调节两种类型胶原蛋白的含量来调节复合水凝胶的性能。通常将胶原蛋白与其他天然生物大分子结合，或通过化学修饰来制备水凝胶。Ⅱ型胶原蛋白和透明质酸（hyaluronic acid, HA）制备的可注射水凝胶，加入软骨细胞后，软骨细胞在培养过程中保持活性，并可维持软骨细胞的表型[24]。与明胶相似，胶原蛋白的机械性能较差，会快速降解，这些对软骨修复是不利的，其改进思路也与明胶相似。

常见的天然水凝胶的类型如表1 所示。另外，应用透明质酸、丝素蛋白、硫酸软骨素同样可以构建水凝胶支架。有研究开发了一种原位光交联的透明质酸作为关节软骨修复的支架材料，将软骨细胞在该水凝胶中体外培养，细胞保持圆形并产生大量的软骨基质。将水凝胶填入软骨缺损处，发现2 周后缺损处积累大量软骨基质[25]。通过化学改性制备的水凝胶具有更好的生物降解性、机械性能及光学交联能力。

表1 常见天然水凝胶的类型

2 水凝胶的评价

水凝胶性质的定量和定性表征是其在软骨修复中应用的关键步骤，这使得水凝胶可根据特定的需求进行设计。在水凝胶的研究中，通常使用不同的方法来表征水凝胶材料。

水凝胶网络中聚合物分子之间的网眼大小可以从10 ～ 500 µm的大孔到5 ～ 100 nm的孔不等，这些孔旨在诱导组织再生[26]。扫描电子显微镜（scanning electron microscope, SEM）和透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM）通常用于观察水凝胶和其他生物材料的表面形态和内部多孔结构。两种设备之间的明显区别是空间分辨率的不同。例如，将水凝胶通过SEM 和TEM 进行观测，SEM 显示水凝胶是具有多孔微结构和孔壁是光滑的，水凝胶的内部结构则可以通过TEM观察，其分辨率可以达到0.2 nm[27]。

水凝胶的物理性质被认为是控制骨骼再生的最重要因素之一。物理性质通常还包括保水能力、溶胀性和水凝胶的包埋率。包封效率可以根据所包埋药物的不同性质，通过分光光度计或高效液相色谱法等进行测定，这也是水凝胶的重要物理性质。毋庸置疑，在软骨修复中测定不同材料和制备方法制成的水凝胶的机械性能非常重要，需测量不同的数据，如压缩模量、拉伸强度及流变性质来评估水凝胶的机械性质。

由于不同官能团和化学键的存在对水凝胶的性能具有显著影响，因此有必要分析制备的水凝胶中存在的不同官能团和化学键。通常使用X射线衍射、傅立叶变换红外光谱、核磁共振和热重分析来分析水凝胶的结构。

在体外进行水凝胶的降解测试时，可将水凝胶材料放入磷酸盐缓冲盐水中，并在37℃下孵育观察一定时间。因为水凝胶材料用作细胞的支架，测试其嵌入细胞和植入部位对材料的安全性是必要的。体外生物相容性测试一般通过细胞实验进行，通过一系列指标观察水凝胶材料中细胞的存活情况。水凝胶支架中细胞的形态可以通过倒置显微镜观察。细胞生长和增殖可以通过MTT 法来测定，AO/PI染色、DAPI染色和刃天青检测也是可行的方法。细胞生长还可以通过分析ECM的合成来评估，可用甲苯胺蓝染料染色并在倒置显微镜下观察[28]。此外，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）是成骨细胞分化的明显特征，也是其分化最常见的指标之一。

3 软骨缺损动物模型

水凝胶的开发主要用于治疗软骨缺损，因此，在应用之前，水凝胶材料与活生物组织之间的相互作用非常重要，尽管通过细胞实验分析了该材料的生物相容性，但证明该材料在体内对细胞无毒是必要的。通过建立动物测试模型，常用的如大鼠、小鼠、兔子等对材料进行测试，以模拟人体的环境和身体状况。

因为要进行标准化评估，所以确定关节软骨缺损的几何形状很重要。动物模型中的关节软骨缺损通常是圆形或矩形的。圆形缺陷可以使用商业或定制的打孔器来创建，如皮肤活检穿孔器。同样，应使用定制打孔器（而不是手术刀片）制造出矩形缺陷来将缺损标准化，之后使用刮匙或勺子仔细清除这些缺损处的关节软骨。创建软骨缺损模型时，必须特别注意进行精细的手术操作。部分研究者认为，缺损一定不能延伸到软骨下骨中[29]，因为这将导致大量骨髓成分的涌入，从而可能干扰单纯软骨的修复方式。然而，笔者认为创建软骨下骨缺损的动物模型是必要的，虽然这增加了修复难度，但也更贴近于实际。

小鼠适合用作验证模型，可以有很多动物样本数目，并且使用来自相同品系的小鼠具有均一性。此外，对于特定的研究，可以使用无胸腺、转基因或基因敲除，以及免疫系统受损的小鼠，这些小鼠会较早出现骨关节炎。例如，Matsuoka等[30]叙述了一种软骨修复小鼠模型，其应用C57Bl/6 小鼠模型对基因操控及深入了解关节表面愈合过程的机制有一定意义。像其他啮齿动物一样，小鼠的饲养和繁殖通常价格不高，而特定基因敲除小鼠的研发和繁育则会更具挑战性，也更加昂贵。

小鼠关节小，关节软骨薄，仅由几个细胞层组成。这使得研究支架对部分或全层软骨缺损的关节软骨修复较难进行。与人类不同，其生长板未闭合，这增加了软骨修复的内在治愈潜力。除了大体、组织学和生化评估外，也可以使用MRI或micro CT进行检查，并且可以进行生物力学测试。

与小鼠相比，大鼠的关节要大得多，但软骨层仍然很薄。在大鼠膝关节中，可在股骨髁或滑车中造出直径最大为3 mm 的软骨甚至骨软骨缺损，该处缺损的临界大小未知。Choi等[31]应用大鼠模型描述了模块化壳聚糖水凝胶在关节内的应用，用以治疗关节软骨缺损。与小鼠类似，大鼠的饲养比较经济，但面临类似的问题，如生长板不闭合会改善体内修复效果。对于结果评估的方法可与小鼠相同。

兔子模型介于小动物模型与大动物模型之间，需要相对简单的饲养。兔子的股骨髁和滑车足够大，可形成最大3 ～ 4 mm的骨缺损或软骨缺损。股骨远端生长板在6 ～ 8个月时闭合[32]。兔子的膝盖弯曲度比人大得多，导致滑车承受力要比人大。兔子的内源性愈合潜力相对较高，其软骨有可能再生。但是，在成年兔子中直径为2 mm 的骨软骨缺损只能修复，不能再生。与大鼠一样，兔子髌骨的软骨部分位于硬骨部分的近端。

4 总结与展望

本文讲述了近年来水凝胶在软骨修复中的设计和应用的研究进展。水凝胶具有很好的生物相容性和生物降解性，有利于细胞存活。软骨组织再生的关键之一是促进软骨整合及软骨下骨再生，因为这两种组织具有不同的结构和性能，因此需要水凝胶支架同时模拟两种组织的性能。另外，软骨修复作用与软骨细胞外基质的沉积和重塑有关，如果材料的降解速率与这不完全匹配，则ECM无法沉积在损害软骨再生的缺损区域。水凝胶具有可控的降解速率、良好的生物相容性和机械性能，是理想的软骨组织工程材料。

毫无疑问，要使软骨完全恢复其本来状态，对结构、力学和生物功能的复原是一项重大挑战，如何实现软骨和软骨下骨再生的整合一直是组织工程学中的关键问题，因为水凝胶支架需要模拟两种不同类型的组织结构和性质。在这种情况下，软骨修复的部分应具有出高弹性模量，以承受压力和摩擦，能增强软骨细胞成软骨的表达，并有助于软骨细胞矿化。另外，软骨下骨修复应能促进水凝胶内血管网络的形成，从而促进营养物质的运输，刺激成骨细胞的增殖，并为软骨再生提供强有力的支持。更重要的是，缺损处周围的软骨与植入物的界面应具有牢固的附着力。尽管水凝胶性能经过不断优化，能够基本满足软骨层的修复需求，然而要开发兼具超高力学强度、高孔隙率和物理结构稳定的天然水凝胶以满足软骨下骨的修复需求还是比较困难。

目前用于关节软骨修复的天然可降解水凝胶的力学强度、弹性模量和韧性还达不到软骨修复要求，如何提高水凝胶的力学性能是目前研究的重点。大量研究通过在高分子水凝胶中引入双网络结构、离子螯合键、氢键、共价键、纳米交联位点、动态的共价键-非共价键及多种交联结构，以获得高强复合水凝胶[33]。受中国浓汤熬制方法启发，Wang等[34]用高温蒸馏浓缩方法提高了天然海藻酸钠、卡拉胶多糖在水中的溶解度，制备出高浓度的多糖水凝胶预聚液。随后，在该混合溶液中加入钙离子和热响应的琼脂糖，最终合成高韧性的天然可降解水凝胶。因水凝胶含有高密度氢键、离子键，使得其拉伸强度、弹性模量和断裂韧性分别高达2 MPa、2 MPa 和1 200 Jm-2。因此，在高浓度天然水凝胶预聚液中引入多种类型的交联结构，通过调控其内部的交联密度和化学组分，有望获得高强度、高韧性、可生物降解的满足关节软骨修复需求的仿生植入材料。

近年来，受关节软骨/软骨下骨组织多级微纳结构的启发，开发纳米梯度复合支架促进关节软骨修复是目前的趋势。有研究采用原位成型方法在海藻酸钠和聚乙烯醇水凝胶的下层和上层分别复合不同浓度的HA和硫酸软骨素/玉米蛋白纳米颗粒制备出纳米梯度复合水凝胶支架[35]。兔子体内膝关节缺损修复结果表明该纳米梯度复合水凝胶能够促进透明软骨和软骨下骨的再生，生物力学结果表明实验组的新生软骨/骨组织与宿主组织界面结合力远远高于空白对照组。此外，软骨/软骨下骨的重建和再生是多种活性生物分子共同参与调控的结果，因此，纳米复合水凝胶结合生长因子的固载为软骨/软骨下骨的修复提供了新思路。

目前，用于临床试验的组织工程产品数量有限，在促进微细加工技术和开发细胞支架方面，朝着更先进和针对性疗法的快速进展仍然值得注意，理想水凝胶应同时具有以下特征：①生物活性和仿生功能；②承受机械应力；③与骨和软骨组织相结合；④运输药物和生长因子。因而，结构复杂的复合水凝胶支架是必须的，以实现良好的临床治疗效果，并应对水凝胶支架的力学和生物学行为进行相应的研究，以确保材料与周围组织有强的相互作用。有了这种理解，未来应该仔细思考设计水凝胶的二级、三级的高级结构，量化其组成、形态、结构和功能，表征它们的结合方式及与细胞表面受体的相互作用，最后将其转变为临床可用的生物材料。笔者坚信，借助水凝胶的不断发展及理化和机械性能的精确调控，会涌现先进的用于临床的生物材料。