miR-124-3p调控激素性股骨头坏死患者骨髓间充质干细胞成骨分化作用的研究*

杨增强 郝飞虎 原天祎 周治衡 崔泳

激素性股骨头坏死（steroid-induced necrosis of femoral head, SINFH）是因为长期使用糖皮质激素及其衍生药物导致的严重骨科疾病。SINFH的主要病理学特点是骨细胞和骨髓的慢性持续性坏死，最终导致股骨头的破坏坍塌[1-3]。虽然药物治疗及核心减压对SINFH 有一定的效果[4]，但早期的干预也只能减轻激素的副作用[5]。因此，寻找SINFH的发病机制和早期治疗的有效方法在骨科领域至关重要。

既往研究表明，SINFH 与骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）的成骨能力和成脂能力失衡有关[6]。骨髓间充质干细胞的分化方向受骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins, BMPs）、Wnt 和Notch 等信号通路，Runx2、C/EBP 和PPARγ 等转录因子，非编码RNA，激素及线粒体等众多因素的调控，任何环节的异常都可能导致病理状态的发生[7]。

非编码RNA（noncoding RNA, ncRNAs）是一类调节基因表达的小分子RNA，可以调控基因的表达和转录[8-9]，在SINFH 中发挥着重要作用[10-11]。CTNNB1 基因可以编码蛋白质β-连环蛋白（β-Catenin），参与调控细胞的增殖和凋亡，以及调节骨形成和骨吸收之间的平衡[12]。有研究发现，miR-322-5p、miR-124-3p、miR-125a-3p和CTNNB1的表达失衡与SINFH 有关[13]。同时，miR-124 对人类BMSC的生物学功能有一定的影响[14]。然而，miR-124-3p、CTNNB1在SINFH中的作用和分子机制仍不清楚。本研究主要探讨SINFH 中miR-124-3p 对BMSCs 的调控作用及其与CTNNB1 的相关性，明确miR-124-3p 对BMSCs 的调控作用，为SINFH的诊治提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

细胞培养箱（美国Thermo Fisher 公司）；超净工作台（苏州安泰科技有限公司）；低温冷冻离心机（德国Sigma公司）；Real-time检测仪（美国Thermo Fisher公司）；研究级倒置显微镜（中国广州市明美科技有限公司）；人骨髓间充质干细胞（中国武汉普诺赛生命科技有限公司）；F12K培养基、FBS（美国Hyclone 公司）；miR-124-3P NC、miR-124-3P mimic、 miR-124-3p inhibitor、 CTNNB1-3'UTR-WT、CTNNB1-3'UTR-MUT 载体（上海吉玛制药技术有限公司）；DMEM、血清、胰酶（美国Gibco 公司）；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（美国Promega 公司）；Trizol 试剂、Lipofectamine™ 3 000（美国Invitrogen 公司）；SYBR Green PCR试剂盒（美国Thermo Fisher公司）；逆转录试剂盒（美国Thermo Fisher 公司）；抗CTNNB1 抗体（美国Abcam公司）。

1.2 一般资料

1.2.1 病例选择

选择在2020 年9 月到2022 年5 月就诊于新疆医科大学第五附属医院行髋关节置换术的患者，术中扩髓时收集骨髓组织。期间收集SINFH 患者病例20 例随机选择15 例作为实验组，收集股骨颈骨折（无SINFH）患者病例28例随机选择15例作为对照组。SINFH诊断定义为平均每日使用类固醇激素剂量16.6 mg 或最高每日剂量80 mg，至少1年[15]，由磁共振图像确认。有慢性疾病、癌症或饮酒的患者被排除在外。本研究经新疆医科大学附属第五医院伦理委员会批准（XYDWFYLS-2019-06），所有方法均按照相关指南和规定进行，患者已知晓此研究并取得同意。

1.2.2 BMSCs来源

细胞培养在DMEM培养基中，其中含有10%胎牛血清细胞（fetal bovine serum, FBS）、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素。用甲泼尼龙（辉瑞，美国）处理细胞建立SINFH细胞模型，浓度为4 mg/106个细胞，每8 h 1次，共处理5次。培养在37℃、5% CO2的培养箱中，用于后续实验。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR检测miR-322-5p、miR-124-3p、miR-125a-3p以及CTNNB1表达

收集实验组和对照组扩髓时的骨髓组织，采用Trizol法提取总RNA，纯化，逆转录获取互补cDNA。反应体系：SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL，cDNA 模板1 μL，上下游引物各0.4 μL。反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，95℃退火5 s，72℃延伸30 s。各引物及其序列如表1 所示。以U6 为内参，采用2-△△CT法计算miR-322-5p、miR-124-3p、miR-125a-3p及CTNNB1表达量。

表1 反应体系中各引物及其序列

1.3.2 Western Blot检测CTNNB1蛋白的表达水平

用冰冻的含蛋白酶抑制剂的放射性免疫沉淀试验（RIPA）裂解缓冲液从骨髓间充质干细胞中提取蛋白质。用10%SDS-PAGE 分离等量的蛋白质，然后转移到聚偏氟乙烯膜上。用脱脂干牛奶阻断后，用特异性一抗孵育膜。然后用酶标二抗孵育膜。以β-肌动蛋白作为内参蛋白，测定CTNNB1蛋白表达水平。

1.3.3 细胞转染及分组

分别用无血清培养基稀释miR-124-3p mimic、miR-124-3p mimic NC、miR-124-3p inhibitor（DNA含量为3 μg），根据Lipofectamine™ 3 000转染试剂说明书转染。依次分为BMSC 组、BMSC+miR124-3p+NC 组、BMSC+miR124-3p+inhibitor 组、BMSC+miR124-3p+mimics 组。转染48 h 后，收集细胞。

1.3.4 转染后各组细胞中miR-124-3p和CTNNB1的表达

取上述细胞接种于24孔板，各组设置3个复孔。待细胞贴壁后，提取RNA 进行q-RTPCR 检测，其反应体系、引物、条件同前。PCR扩增后，实时荧光定量PCR仪自动分析结果，采用2-△△CT法计算miR-124-3p 和CTNNB 的相对表达量。Western Blot操作同前。

1.3.5 分化能力评估

取转染分组后细胞接种于培养皿，使其汇合度为70% ～ 80%。分为两组，分别弃去原培养基，一组进行成骨诱导（osteoblasts induction, OI）分化，添加成骨诱导培养基（内含50 mM 抗坏血酸、100 nM 地塞米松、10 mM β‐磷酸甘油和15%胎牛血清），另一组进行成脂诱导（adipogenic induction, AI）分化，添加成脂诱导培养基（内含10 μg/mL 胰岛素，1 μM 地塞米松，0.5 mM IBMX 和0.1 mM吲哚美辛）。2 d换液一次，15 d后分别进行茜素红染色和油红O染色，显微镜下观察拍照。

1.3.6 miR-124-3p与CTNNB1的靶向验证

利用生物信息学数据库Starbase 预测miR-124-3p 与CTNNB1的结合位点。转染前一天，将细胞接种于24孔板内，使其汇合度为70% ～ 80%。按照试剂盒说明书步骤提取质粒，然后将miR-124-3p mimics和提取的质粒共转染进BMSCs。具体组别为CTNNB1-3'UTR-WT+NC、CTNNB1-3'UTR-WT+hsa-miR-124-3p mimic、CTNNB1-3'UTR-MUT+hsa-miR-124-3p mimic，48 h后，依据双荧光素酶报告基因检测试剂盒（Promega）使用说明检测海肾荧光素酶（RL）和萤火虫荧光素酶（FL）的强度。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。所有数据均以均数±标准差表示，组间差异采用t检验，两两比较采用LSDt检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者BMSCs 中miR-322-5p、miR-124-3p、miR-125a-3p及CTNNB1表达

qRT-PCR实验结果显示，实验组BMSCs中miR-124-3p的表达量低于对照组，miR-125a-3p 和CTNNB1 的表达量高于对照组（P＜0.001），miR-322-5p的表达量未见明显差异，见图1。

图1 qRT-PCR实验结果：A. miR-124-3p表达水平；B. miR-322-5p表达水平；C. miR-125a-3p表达水平；D. CTNNB1表达水平

2.2 Western Blot检测CTNNB1蛋白的表达水平

Western Blot结果显示，实验组CTNNB1蛋白表达水平高于对照组（P＜0.05），差异具有统计学意义，结果见图2。

图2 CTNNB1 蛋白Western Blot 检测结果：A. CTNNB1 蛋白电泳条带；B. CTNNB1相对表达水平

2.3 转染后各组miR-124-3p和CTNNB1表达比较

转染miR-124-3p mimics组miR-124-3p表达量高于BMSC组和BMSC+miR124-3p+NC 组（P＜0.001），而CTNNB1表达量低于BMSC组和BMSC+miR124-3p+NC组（P＜0.001）；转染miR-124-3p inhibitor 组miR-124-3p 表达量低于BMSC组和BMSC+miR124-3p+NC 组（P＜0.001），CTNNB1表达量高于BMSC 组和BMSC+miR124-3p+NC 组（P＜0.001），见图3。

图3 转染后各组miR-124-3p 和CTNNB1 表达量：A. 转染后miR-124-3p的表水平；B. 转染后CTNNB1的表达水平

2.4 转染后CTNNB1蛋白的表达水平

Western Blot 结果显示，BMSC 组和转染miR-124-3p+NC组CTNNB1蛋白表达水平没有差异。转染miR-124-3p+inhibitor 组和BMSC 组相比，CTNNB1 蛋白表达水平较高（P＜0.001）。转染miR-124-3pmimics 组和BMSC 组相比，CTNNB1蛋白表达水平较低（P＜0.001）。结果见图4。

图4 转染后CTNNB1 蛋白Western Blot 检测结果：A. CTNNB1 蛋白电泳条带；B. 各组CTNNB1表达水平

2.5 分化能力评估

2.5.1 成骨分化结果

BMSCs成骨诱导15 d后进行茜素红染色，结果显示各组有红色钙结节形成，提示成功诱导BMSCs向成骨细胞分化，结果见图5。

图5 成骨诱导分化结果：A. BMSCs+OI组；B. BMSCs+OI+NC组；C. BMSCs+OI+miR-124-3p+mimic组；D. BMSCs+OI+inhibitor组

2.5.2 成脂诱导结果

BMSCs 成脂诱导15 d 后进行油红O 染色，结果显示，各组有脂滴形成，提示成功诱导BMSCs 向脂肪细胞分化，结果见图6。

图6 成脂诱导结果：A. BMSCs+AI 组；B. BMSCs+AI+NC 组；C. BMSCs+AI+miR-124-3p mimic 组；D. BMSCs+AI+miR-124-3p inhibitor组

2.5.3 成骨和成脂诱导数据分析结果

在对成骨诱导实验结果进行分析后发现，与BMSCs+OI组和BMSCs+OI+NC 组相比，BMSCs+OI+miR-124-3p mimic组染色区域扩大（P＜0.01）；BMSCs+OI+miR-124-3p inhibitor 组染色区域减小（P＜0.01），这提示BMSCs+OI+miR-124-3p mimic组钙沉积多于其他组，过表达miR-124-3p可以促进BMSCs 的成骨分化；抑制miR-124-3p 表达则结果相反，结果见图7。

图7 染色区域相对面积：A. 成骨诱导茜素红染色区域相对面积； B. 成脂诱导油红O染色区域相对面积

在对成脂诱导实验结果进行分析后发现，与BMSCs+AI 组和BMSCs+AI+NC 相比， BMSCs+AI+miR-124-3p mimic 组染色区域减少（P＜0.01），BMSCs+AI+miR-124-3p inhibitor 组染色区域扩大（P＜0.01），这提示BMSCs+AI+miR-124-3p inhibitor 组脂滴形成增多，而BMSCs+AI+miR-124-3p mimic 组脂滴形成较少，过表达miR-124-3p 可抑制BMSCs 的成脂分化；抑制miR-124-3p 表达则结果相反，结果见图7。

2.6 miR-124-3p与CTNNB1的靶向验证结果

Starbase 数据库中检索发现，CTNNB1-3'UTR 含有miR-124-3p的结合位点。实验结果显示与对照组相比，转染miR-124-3p mimic 的野生型CTNNB1 荧光素酶报告质粒相对活性下降（P＜0.01）。而CTNNB1-MUT 组与对照组荧光素酶活性相比，两者活性相当，差异无统计学意义（P＞0.05）。说明CTNNB1-WT 与miR-124-3p 存在靶向关系，结果见图8。

图8 CTNNB1 与miR-124-3p 的结合位点和双荧光素酶实验结果：A. CTNNB1与miR-124-3p的结合位点；B. 双荧光素酶实验结果

3 讨论

激素性股骨头坏死（SINFH）是激素的副作用导致的髋关节退行性病变。截至目前，其潜在的发病机制仍然不清楚，这限制了人们对激素性股骨头坏死的诊断和治疗，虽然早期可以通过髓内减压和移植骨瓣等手段缓解病情[16-17]，但远期的效果并不理想，给医生和患者带了很大困扰。

MiRNA作为一类高度保守的内源性非编码单链RNA，在调节基因表达中起着重要作用[18]。大量的研究表明，miRNAs 参与调控脂质和骨代谢[19-20]，从而影响SINFH 的发生发展过程。在本研究中，笔者证实miR-124-3p和miR-125a-3p在实验组和对照组中差异表达，且实验组miR-124-3p 表达量低于对照组，miR-125a-3p 表达量高于对照组。miR-124-3p作为一种基因调控因子，对细胞的增殖、凋亡和分化起着很重要的作用，miR-124-3p可以与STAT3结合抑制鼻咽癌细胞的增殖和转移[21]。同时miR-124-3p可以调控血管平滑肌细胞、心肌细胞和神经元细胞的增殖和凋亡[22-24]，过表达miR-124-3p 可以增强细胞活性，减缓细胞凋亡。有学者在对绵羊基质血管组分（stromal vascular fraction, SVF）分化研究中发现，过表达miR-124-3p 可以减弱SVF 成脂作用，抑制miR-124-3p 表达则结果相反[25]。这与本研究结果吻合，本研究中过表达miR-124-3p促进了BMSCs 的成骨作用，减弱了BMSCs 的成脂作用。过量激素诱导骨髓间充质干细胞可造成骨标志物Alpl、Bglap 和Runx2 的降低，但过表达miR-124-3p 可以逆转骨髓间充质干细胞的生理活动，促进Alpl、Bglap和Runx2等成骨标志物的表达[26]。

CTNNB1编码β-catenin蛋白，钙粘蛋白黏附复合物的组成部分，调节细胞-细胞黏附和典型Wnt信号通路中的基因表达，典型的Wnt/β-catenin信号通路是祖细胞增殖和分化的重要调节因子，是各种人类疾病发病机制的核心，包括那些影响骨骼发育和肿瘤进展的疾病。在维持关键的生物稳态方面受到高度调控。CTNNB1的异常积累与大多数癌症有关。研究发现，抑制CTNNB1可抑制肾癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡。过表达CTNNB1可以促进肾透明细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭，抑制细胞凋亡[27]。CTNNB1 变异与儿童硬化性骨发育不良和肾上腺皮质腺瘤[28]、痉挛性双瘫痪和视觉缺陷的神经发育障碍[29]以及子宫内膜异位症细胞增殖和侵袭[30]紧密相关。大量研究证实，Wnt信号通路可以调节骨骼和骨量发育，激活Wnt/β-catenin 信号通路可以促进BMSCs 的成骨分化[31-33]。β-catenin 是Wnt 信号通路的组成部分，并且是该信号通路的核心蛋白，其活性和含量对BMSCs的成骨分化具有重要作用[34]。本研究中双荧光素酶实验结果显示，miR-124-3p与CTNNB1 有潜在的结合位点，提示miR-124-3p 可能在Wnt信号通路中发挥一定作用，然而miR-124-3p/CTNNB1发挥的功能、发挥功能的途径及下游的靶基因仍需进一步的研究。

在本研究中，笔者对激素诱导的股骨头坏死患者骨髓组织进行了研究，发现在SINFH患者体内miR-124-3p的表达量下降，CTNNB1的表达量升高；进一步实验证实过表达miR-124-3p 可以促进BMSCs 的成骨分化；同时miR-124-3p和CTNNB1有靶向结合关系。为激素性股骨头坏死的研究提供了一个新思路，做出了一定的补充。

总而言之，本研究表明，miR-124-3p在SINFH患者中表达量下降，miR-124-3p 可以靶向结合CTNNB1，并且过表达miR-124-3p可以促进BMSCs的成骨分化。