基于RNA-Seq 筛选高粱低氮胁迫相关候选基因

王 瑞 张福耀 詹鹏杰 楚建强 晋敏姗 赵威军 程庆军,*

1 山西农业大学高粱研究所 / 高粱遗传与种质创新山西省重点实验室, 山西晋中 030600; 2 西北农林科技大学农学院, 陕西杨凌 712100

高粱(SorghumbicolorL. Moench)是世界第五大禾谷类作物, 可用于食用、饲料、酿造、饲草、制糖、生物质能源等领域, 在全球农业生产中占有重要地位[1-2]。高粱也是我国的重要农作物之一, 主产区在东北、华北、西南等区域, 在支撑酿造产业、农牧业生产中发挥着重要作用[3-5]。高粱具有抗旱、耐盐碱和耐贫瘠等多重抗性, 与其他主要谷类作物相比, 在限氮条件下高粱有更高的氮吸收和利用效率, 从而能获得较高产量[6]。在过去的几十年, 増施氮肥对作物增产发挥了重要作用, 但过量施氮既浪费资源又带来一系列的环境污染问题[7-10]。因此, 减少氮肥施用量、提高氮肥利用效率和促进农业可持续发展已成为当今农业生产研究中的热点问题。而研究作物的氮素吸收利用机理、培育氮高效品种是合理利用肥料、减少环境污染的有效途径之一。目前, 对作物氮效率的相关研究主要集中在水稻[11-14]、小麦[15-17]、玉米[18-20]等谷类作物, 高粱的研究较少[21]。

近年来, 随着测序技术的迅猛发展和测序成本的大幅下降, 高通量测序已成为植物基因组和转录组等众多组学研究的首选测试分析手段, 越来越多的研究从组学入手, 深入解析作物在低氮胁迫下的响应。Singh 等[22]用玉米耐低氮自交系DMI 56 和氮敏感自交系DMI 81 的叶和根进行转录组分析。基于KEGG 和Mapman 分析表明, 大部分差异表达基因(DEGs)可通过多种代谢途径参与调控, 包括次生代谢产物的生物合成、信号转导、氨基酸代谢、氮同化代谢和淀粉代谢。与敏感型相比, 耐受基因型中一些涉及氮吸收(高亲和力硝酸盐转运蛋白NRT2.2和NRT2.5)、氮同化和代谢(谷氨酰胺合成酶、天冬酰胺合成酶)、氧化还原平衡(SOD、POX)和转录因子(MYB36、AP2-EREBP)的关键基因表达量较高。Ge 等[23]对低氮胁迫下谷子幼苗的转录组进行分析,筛选出1891 个差异表达基因, 其中上调基因1318个, 下调基因573 个; 3%基因参与膜转运, 5%基因参与氧化还原过程。基因功能分析表明, 在低氮胁迫下SiMYB3 通过调控植物根系生长素合成来调控根系发育。Sultana 等[24]采用RNA-Seq 分析方法, 对3个澳大利亚小麦品种的叶和籽粒进行转录组研究。在低氮胁迫下共鉴定出12,344 个差异表达基因, 其中下调基因主要与碳水化合物代谢过程、光合作用、捕光和防御反应有关, 上调基因主要与核苷酸代谢、蛋白质水解和跨膜转运有关。Ding 等[25]对谷子郑204 在低氮胁迫下的转录分析表明, SiMYB42 转录因子在低氮胁迫下表达上调, 它可能通过调控硝酸盐转运基因的表达来增强谷子对低氮胁迫的耐受性。Yan 等[26]对小麦XM26 和LM23 两个品种的根和芽进行了低氮和正常处理下的转录组分析, 钙介导的植物-病原体相互作用、MAPK 信号通路和磷脂酰肌醇信号通路在XM26 中富集, 而在LM23 中不富集, 表明钙相关途径在2 个品种中发挥不同的作用, 引起不同的耐低氮胁迫。Zhang 等[27]从大豆根茎、叶、花和种子的全基因组序列中鉴定出64 个假定的GATA 因子。在低氮胁迫下, GATA44 和GATA58可能参与了大豆氮素代谢的调控。NLP 是硝酸盐应答顺式元件结合蛋白, 在硝酸盐调控表达中起转录激活的作用。Jagadhesan 等[28]通过对水稻叶和根的研究揭示了NLP 转录因子在低氮胁迫抗性中的作用。关于高粱在低氮胁迫下转录响应的研究, Gelli等[29]利用全基因组转录分析鉴定了7 个高粱基因型的根(4 个耐低氮高粱基因型-三尺三、China17、KS78、高氮bulk 和3 个敏感基因型-CK60、BTx623低氮bulk)耐低氮胁迫差异表达基因。在敏感基因型中, 低氮胁迫增加了与应激反应(包括氧化应激和刺激)相关的DEG 转录本的丰度。在耐受型基因型中,高亲和力硝酸盐转运体(NRT2.2、NRT2.3、NRT2.5和NRT2.6)和赖氨酸组氨酸转运体1 (LHT1)转录本丰度高, 表明提高无机和有机氮的吸收效率; 较高丰度的SEC14 细胞质因子家族蛋白转录物可提高膜的稳定性和对氮胁迫的耐受性。Zhu 等[30]对高粱BTX623 幼苗的芽和根低氮转录组分析, 筛选出4292 个DEGs (3243 个表达上调和1049 个表达下调);GO 和KEGG 通路分析表明, 缺氮反应与光合作用和蛋白质运输等功能相关; 另外为了研究氮磷钾营养缺乏下的单一营养素是否对基因表达水平有交互影响, 他们选择了几个已知的氮磷钾相关基因来检、、查它们在单一和联合缺乏下的表达情况, 结果表明,大多数低氮相关基因, 如硝酸盐和铵转运体Sb04g024090、Sb04g026290 和Sb01g001970 在缺氮磷钾植株和缺氮植株的茎和根中的表达模式相似,硝酸盐转运体Sb03g032310 在低氮下在茎和根中表达强烈。此外, Massel 等[31]利用44 组高粱重测序数据分析了230 个参与氮吸收和代谢的基因的遗传变异和选择压力, 为高粱氮肥利用相关基因发掘奠定基础。本研究选取2 个耐低氮型高粱品种(BSX44 和BTx378)为试验材料, 设置正常和低氮胁迫2 个处理,采用转录组测序技术, 分别在苗期、抽穗期和开花期取叶片提取总RNA, 再经mRNA 纯化、反转录、文库构建及转录组测序等一系列过程, 在2 个氮处理下, 对不同基因型高粱进行生物信息学分析。从mRNA 水平对高粱缺氮过程中基因的表达进行探测,全面地搜索影响氮效率的相关基因及表达水平。该研究旨在了解高粱响应低氮胁迫的分子机制, 为鉴定和培育适应低氮的种质资源提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验在课题组[21,32]前期筛选研究基础上, 选用耐低氮品种BTx378 和BSX44, 参照刘鹏等[32]采用盆栽试验, 设置正常生长(0.24 g kg-1风干土)和低氮胁迫(0.04 g kg-1风干土) 2 个处理种植, 分别在苗期取第三叶、抽穗期和开花期取倒二叶, 各处理均选取3 盆高粱, 采样后保存在液氮中。利用TRIzol 法提取RNA, 提取的总RNA 使用超微量核酸蛋白测定仪(scandrop100)测定其纯度及浓度, 确保质量合格。将样品送北京百迈客生物科技有限公司进行转录组测序, 根据基因在不同样品中的表达量进行差异表达分析、差异表达基因功能注释和功能富集等表达水平分析, 挖掘参与高粱低氮胁迫的关键候选基因及其调控途径。

1.2 试验方法

1.2.1 转录组样品 分别在苗期、抽穗期和开花期进行转录组测序分析, 转录组样品和分组见表1和表2 (NN 为正常氮、LN 为低氮; R1 和R2 分别为BTx378 和BSX44; S1 为苗期、S2 为抽穗期、S3 为开花期)。

表1 转录组样品Table 1 Transcriptome sample

表2 转录组样品分组Table 2 Groups of transcriptome sample

1.2.2 转录组验证 为验证转录组测序结果的准确性, 随机挑选6 个低氮胁迫关键差异基因在2 个耐低氮高粱品种进行qRT-PCR 验证。利用NCBI 设计引物(表3), 以SbActin为内参基因, 利用Bio-Rad实时荧光定量PCR 系统(伯乐, 美国)进行荧光定量检测。每个样品3 次生物学重复, 以2-ΔΔCT相对定量法计算相对表达量。

表3 引物信息Table 3 Information of the primers

1.2.3 差异表达基因筛选 通过比较不同样本间的数据从而筛选出差异表达基因, 使用DESeq 进行差异基因分析。采用TPM (transcripts per million)作为衡量基因表达水平的指标在差异表达基因检测过程中, 将Fold Change≥2 且FDR＜0.01 作为筛选标准。差异倍数(Fold change)表示两样品(组)间表达量的比值。错误发现率(False discovery rate, FDR)是通过对差异显著性P值(P-value)进行校正得到的。采用公认的Benjamini-Hochberg 校正方法对原有假设检验得到的显著性P值(P-value)进行校正, 并最终采用FDR 作为差异表达基因筛选的关键指标。

1.2.4 差异基因的GO 和KEGG 富集分析 对检测到的差异表达基因(DEGs)进行基因本体 GO[33](Gene ontology, http://www.geneontologyorg/)功能显著性富集分析, 利用R 语言中的richR 程序包将差异基因进行功能分类及富集分析, 当显著性P＜ 0.05时认为该功能项为富集项。

KEGG[34](Kyoto encyclopedia of genes and genomes, http://www.genome.jp/kegg/)是一个基于分子水平信息的大规模分子数据集, 用于了解生物高级功能的系统。采用 Pathway 显著性富集分析, 以KEGG 数据库中Pathway 为单位, 应用超几何检验,找出与参考基因组背景相比, 在差异表达基因中显著性富集的Pathway[35]。并借助KOBAS (2.0)[36]将差异基因进行Pathway 富集分析。当P＜ 0.05 时, 表示差异基因在该Pathway 中显著富集。

2 结果与分析

2.1 RNA-Seq 测序数据质量分析

在正常和低氮条件下, 将BTx378 和BSX44 在苗期、抽穗期和开花期取样进行转录组测序, 表4 为转录组测序数据质控信息, 正常和低氮胁迫下BTx378和BSX44 叶片3 个时间点(低氮胁迫苗期、抽穗期和开花期) GC 含量范围在55.45%～57.58%之间, Q30 碱基百分比高于91.53%; 表明转录组测序样品组间差异较小、测序数据可靠, 可用于后续分析。

表4 测序数据质量评估Table 4 Quality evaluation of RNA sequencing data

2.2 差异表达基因的qRT-PCR 验证

为进一步探索差异表达基因在低氮胁迫下的表达模式, 通过qRT-PCR 对随机选择的6 个基因在不同时期的表达量进行验证。结果显示, qRT-PCR 和RNA-Seq 的表达趋势一致, 说明转录组RNA-Seq 数据较为可靠, 可用于后续的分析(图1)。通过对参与低氮胁迫响应相关差异表达基因的分析发现, 这些基因随着低氮胁迫时间的持续, 均表现出差异表达。表明这些显著上调或者下调的基因, 与高粱耐低氮相关, 探索具有相似表达谱的基因, 将有助于我们定位更多参与低氮胁迫的重要候选基因, 构建参与高粱低氮耐受的表达网络。

图1 部分差异表达基因qRT-PCR 验证Fig. 1 qRT-PCR validation of partially differentially expressed genes

2.3 差异表达基因筛选

2.3.1 低氮胁迫不同时期差异表达基因数目统计

对2 个耐低氮高粱品种在低氮处理不同时期的差异表达基因进行筛选(表5)发现, 低氮处理苗期R1 共筛选937 个差异表达基因, 其中464 个基因上调表达(49.52%)、473 个基因下调表达(50.48%) (对比组1); R2 共筛选出787 个差异表达基因, 其中264个基因上调表达(33.67%)、523 个基因下调表达(66.33%) (对比组2)。

表5 差异表达基因数目统计Table 5 Statistics of differentially expressed genes (DEGs)

低氮胁迫抽穗期R1 共筛选1305 个差异表达基因, 其中637 个基因上调表达(48.81%)、668 个基因下调表达(51.19%) (对比组3); R2 共筛选出935 个差异表达基因, 其中432 个基因上调表达(46.20%)、503 个基因下调表达(53.80%) (对比组4)。

低氮胁迫开花期R1 共筛选1402 个差异表达基因, 其中394 个基因上调表达(28.03%)、1008 个基因下调表达(71.97%) (对比组5); R2 共筛选出963 个差异表达基因, 其中384 个基因上调表达(39.88%)、579 个基因下调表达(60.12%) (对比组6)。

2.3.2 低氮胁迫不同时期差异表达基因韦恩分析

耐低氮高粱品种分别在低氮处理不同时期苗期、抽穗期和开花期的差异表达基因分析发现, 在低氮胁迫苗期、抽穗期和开花期分别有246、371 和306 个基因在2 个耐低氮高粱品种中共同差异表达(图2)。

图2 差异表达基因韦恩分析Fig. 2 Venn diagram of differentially expressed genes

2.4 低氮胁迫下不同时期差异表达基因的富集分析

为了进一步鉴定差异表达基因的生物学功能,分别对苗期、抽穗期和开花期3 个不同时期, 2 个耐低氮高粱品种中共同差异表达的基因进行GO 功能富集分析和KEGG 代谢通路富集分析, GO 富集分析主要分为细胞组分(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)和生物过程(biological process, BP) 3 个亚组。

2.4.1 低氮胁迫苗期差异基因的富集分析 低氮胁迫下, 对苗期2 个耐低氮材料中均差异表达的246个基因进行GO 功能富集与KEGG 代谢通路富集分析发现(图3), 这些基因主要富集包括生物过程、细胞组分和分子功能3 个分类下的43 个GO term。生物过程共富集到19 个GO term, 主要是氧化还原过程(GO:0055114)、对脱落酸的响应(GO:0009737)、对磷酸盐饥饿响应(GO:0016036)、半乳糖生物合成过程(GO:0019375)、转录负调控(GO:0045892)、硝酸盐转运(GO:0015706)、磷酸盐离子运输(GO:0006817); 细胞组分共富集到13 个GO term, 主要包括细胞(GO:0005623)、细胞膜(GO:0016020)、细胞器(GO:0044464)、大分子复合物(GO:0032991)、共质体(GO:0055044); 分子功能共富集到11 个GO term, 与催化活性(GO:0003824)、转运活性(GO:0005215)、核酸结合转录因子活性(GO:0001071)、电子载体活性(GO:0009055)、分子转导活性(GO:0060089)、信号转导途径(GO:0004871)、结构分子活性(GO:0005198)、抗氧化活性有关(GO:0016209)。代谢通路富集分析, 对显著富集的前20 条通路进行统计分析发现, 在低氮胁迫苗期, 差异基因主要富集在碳代谢、氨基酸的生物合成、甘油酯代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、半乳糖代谢、果糖与甘露糖代谢、糖酵解通路、参与氨基糖和核苷酸糖代谢、β-丙氨酸代谢、氮素代谢等过程。

2.4.2 低氮胁迫抽穗期差异基因的富集分析 对低氮胁迫抽穗期在2 个耐低氮高粱材料中均差异表达的371 个基因进行GO 功能注释富集与KEGG 代谢通路富集分析发现(图4), 这些基因主要富集包括生物过程、细胞组分和分子功能3 个分类下的41 个GO term。生物学过程共富集到18 个GO term, 主要包括缺水响应(GO:0009414)、对伤害的响应(GO:0009611)、对冷害的响应(GO:0009409)、高渗盐响应(GO:0042538)、乙烯响应(GO:0009723)、对茉莉酸的响应(GO:0009753)及磷酸盐饥饿响应过程(GO:0016036); 细胞组分共富集到12 个GO term,主要包括细胞(GO:0005623)、细胞膜(GO:0016020)、细胞器(GO:0044464)、大分子复合物(GO:0032991)、共质体(GO:0055044); 分子功能共富集到11 个GO term, 主要包括与催化活性(GO:0003824)、转运活性(GO:0005215) 、 核酸结合转录因子活性(GO:0001071)、电子载体活性(GO:0009055)、分子转导活性(GO:0060089)、信号转导途径(GO:0004871)、结构分子活性(GO:0005198)、抗氧化活性有关(GO:0016209)。代谢通路富集分析, 对显著富集的前20条通路进行统计分析结果发现, 在低氮胁迫抽穗期,差异基因主要富集在氨基酸生物合成、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、2-氧代环戊烷羧酸甲脂代谢、光合作用、甘油酯代谢、氮代谢等过程。

(图4)

2.4.3 低氮胁迫开花期差异基因的富集分析 对低氮胁迫开花期2 个耐低氮高粱材料中均差异表达的306 个基因进行GO 功能富集与KEGG 代谢通路富集分析发现(图5), 这些基因主要富集包括生物过程、细胞组分和分子功能3 个分类下的42 个GO term。生物学过程共富集到19 个GO term, 主要包括镉离子反应(GO:0046686)、对冷害的响应(GO:0009409)、过氧化氢响应(GO:0042542)、对伤害的响应(GO:0009611)、对高光强的响应(GO:0009644)、对热的响应(GO:0009408)、细胞对磷酸盐饥饿的反应(GO:0016036); 细胞组分共富集到13 个GO term,主要涉及到细胞(GO:0005623) 、 细胞膜(GO:0016020)、细胞器(GO:0044464)等组分; 分子功能共富集到10 个GO term, 主要包括与催化活性(GO:0003824)、转运活性(GO:0005215)、核酸结合转录因子活性(GO:0001071)、电子载体活性(GO:0009055)。代谢通路富集分析, 对显著富集的前20 条通路进行统计分析发现, 低氮胁迫开花期时差异基因主要参与了内质网蛋白加工、氨基酸生物合成、淀粉与蔗糖代谢、谷胱甘肽代谢过程及氨基酸代谢过程等。

(图5)

2.5 耐低氮相关的差异表达基因分析

苗期、抽穗期和开花期3 个时期对2 个耐低氮品种中差异表达的基因进行挖掘。结果发现, 低氮胁迫下, 共有28 个基因在2 个耐低氮品种的不同生育时期均差异表达, 其中有 5 个基因上调表达, 23 个基因下调表达(图6)。热图是展示基因表达差异非常直观的方法, 将不同高粱与低氮胁迫相关的28 个DEGs 进行聚类分析发现(图7), 基因Sb04g034160、Sb06g016540、Sb04g021010在正常条件下表达丰度最高。正常与缺氮相比较,Sb07g 028630、Sb01g015190、Sb01g032250、Sb03g045170、Sb06g025950等5 个基因表达整体呈上调趋势, 其他23 个基因表达整体呈下调趋势(表6), 这将为进一步分析与低氮胁迫的基因在不同高粱中的调控作用提供依据。

图6 差异表达基因韦恩分析Fig. 6 Venn diagram of differentially expressed genes

表6 共同差异表达基因相关信息Table 6 Related information of common differentially expressed genes

2.5.1 共同差异表达基因KEGG 相关代谢通路富集分析 代谢通路富集分析发现, 共同差异基因参与氮代谢、丙氨酸, 天冬氨酸和谷氨酸代谢、甘油磷脂代谢、氨基酸的生物合成、醚脂代谢、2-氧羧酸代谢、乙醛酸盐和二羧酸盐代谢、磷脂酰肌醇信号系统、光合作用、甘油脂代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、光合生物中的碳固定、内吞作用和碳代谢(表7 和图8)。其中代谢路径重要的基因:Sb04g034160参与氮代谢(ko00910);Sb06g031460参与氮代谢(ko00910), 谷氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(ko00250), 氨基酸的生物合成(ko01230), 乙醛酸和二羧酸代谢(ko00630), 精氨酸和脯氨酸代谢(ko00330);Sb01g023750参与丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(ko00250), 氨基酸的生物合成(ko01230),2-氧羧酸代谢(ko01210), 光合生物的固碳作用(ko00710), 碳代谢(ko01200);Sb01g032250参与甘油磷脂代谢(ko00564), 磷脂酰肌醇信号系统(ko04070), 甘油脂代谢(ko00561);Sb03g012720参与甘油磷脂代谢(ko00564), 醚脂代谢(ko00565), 内吞作用 (ko04144);Sb01g006100参与光合作用(ko00195)。

表7 共同差异表达基因KEGG 富集通路Table 7 KEGG enrichment pathway of common differentially expressed genes

2.5.2 差异表达基因的同源基因比对 将2 个耐低氮品种苗期1478 个、抽穗期1869 个和开花期2059个差异表达基因与Massel 等[31]关于高粱氮吸收和代谢途径中的230 个基因进行比较, 发现15 个相同的高粱基因。这些基因在低氮条件下, 苗期、抽穗期和开花期的表达不同(表8)。其中,Sb01g001970在2个耐低氮品种低氮处理后的各个时期都表达上调,Sb10g026090在各个时期都表达下调。

表8 高粱氮吸收和代谢途径中的15 个基因和玉米、水稻的同源基因及在不同时期的表达情况Table 8 15 genes in the nitrogen uptake and mobilization pathway of orthologous maize and rice genes during different periods

3 讨论

高粱起源于土壤相对贫瘠的非洲, 与其他作物相比耐贫瘠性好, 氮肥吸收利用效率高。然而, 不同高粱遗传材料之间氮肥吸收利用效率变异广泛。因此, 探究参与调控高粱氮肥吸收利用的基因表达网络, 挖掘优异基因对于提高高粱氮肥利用率, 减少化肥施用, 推动农业绿色发展有重要意义。本研究利用2 个高粱耐贫瘠材料通过转录组分析分别鉴定了246、371 和306 个在苗期、抽穗期和开花期共同差异表达的基因。这些基因功能主要集中在氮代谢、丙氨酸, 天冬氨酸和谷氨酸代谢、甘油磷脂代谢以及氨基酸的生物合成等通路, 揭示了高粱响应低氮胁迫转录组学变化。同时, 本研究发掘了28 个在不同取样时期均差异表达的基因, 为后续功能基因发掘奠定了基础。

3.1 植物应答低氮胁迫的转录调控研究

当土壤中的氮素亏缺时, 植物会对低氮信号作出感应, 通过信号转导调节体内氮相关基因的表达,从而调控植物体内的生理生化反应。Miyake 等[37]在大豆中分离鉴定GmMYB101基因在低氮胁迫下上调表达。Lea 等[38]在低氮条件下发现拟南芥MYB12的表达水平显著上调。胡利斧[39]研究谷子SiMYB3基因在低氮、低钾和低磷条件下的表达均显著提高。Zhu 等[30]对高粱BTX623 幼苗氮、磷、钾相互作用的转录组分析表明, 大多数低氮相关基因, 如硝酸盐和铵转运体Sb04g024090、Sb04g026290和Sb01g001970在缺氮磷钾植株和缺氮植株的茎和根中的表达模式相似, 硝酸盐转运体Sb03g032310在低氮下在茎和根中表达强烈。本研究在苗期, 铵转运体Sb01g001970在BTx378 和BSX44 两个高粱材料中表达上调, 硝酸盐转运体Sb03g032310在BSX44 中表达明显下调。Massel 等[31]关于高粱氮吸收和代谢途径中的230个基因中也包含Sb01g001970基因。本研究发现共同差异基因主要集中在氮代谢、丙氨酸, 天冬氨酸和谷氨酸代谢、甘油磷脂代谢、氨基酸的生物合成等途径, 这与前人对烟草[40]、水稻[41]低氮胁迫下的转录组分析结果基本一致。本研究对2 个耐低氮型高粱低氮胁迫后, 在苗期、抽穗期和开花期3 个时期,Sb01g032250等5 个基因都表达上调,Sb04g034160、Sb06g031460、Sb01g032250、Sb03g012720、Sb01g 006100等23 个基因都表达下调, 可能这些基因可能影响氮素的利用效率。这28 个不同时期均差异表达的基因可以作为进一步功能分析的重点, 探究其在高粱氮肥吸收利用中的作用。

3.2 低氮胁迫对高粱不同生育时期代谢通路的影响

当植物应对不良环境时, 植物体内代谢物的种类和数量会发生一些变化, 包括代谢通路会发生不同程度的变化来应对逆境以免造成伤害。氨基酸作为蛋白质合成的基本单元, 在植物逆境胁迫中能够作为渗透调节物质并维持生物膜稳定[42]。本研究中,在高粱不同生育时期氨基酸生物合成过程都受影响,说明低氮胁迫下, 氨基酸能够降低渗透势, 增强抗逆性, 维持其正常生理特性。植物氮代谢与碳代谢紧密相关。碳代谢提供碳源和能量可促进氮代谢进行, 氮代谢可以为碳代谢提供酶和蛋白供应植株发育[43]。本研究在低氮胁迫下, 苗期影响碳代谢, 参与碳代谢协调氮代谢从而共同影响植物的生长发育。可溶性糖在植物体内是重要的碳源, 也是重要的渗透调节剂, 对植物抗逆有至关重要的促进作用[44]。本研究低氮胁迫下, 苗期与糖代谢有关半乳糖代谢、果糖与甘露糖代谢以及开花期的淀粉与蔗糖代谢显著加强, 在抵御低氮胁迫发挥重要作用。能量代谢对植物抵御不利环境胁迫至关重要, 也最容易受到不利环境影响[45]。糖酵解是维持细胞重要的能量合成途径以及生产碳骨架方面扮演着重要角色,能应对不良环境[46]。本研究低氮条件下, 苗期与糖酵解有关的代谢过程显著积累, 从而增强能量代谢反应, 这表明糖酵解是高粱适应低氮环境的重要能量代谢。

3.3 低氮胁迫对氮代谢的影响

氮营养是植物生长必不可少的重要因素[47], 影响植物的许多生物过程。植物根系从土壤中获取的氮素主要形式是NO3-和NH4+。植物需要经历NO3-无机氮同化和NH4+有机同化, 植物吸收的NO3-需还原为NH4+才能被吸收, NH4+在GS/GOGAT 途径分别被同化成谷氨酰胺和谷氨酸[48-49], 谷氨酰胺和谷氨酸基本上为所有的氨基酸、核酸和其他含氮化合物(如叶绿素)的生物合成提供氮素。然后谷氨酰胺和谷氨酸可用于形成天冬氨酸和天冬酰胺。这4 种氨基酸共同完成有机氮的输送和转化[50-51]。

Sb04g034160参与氮代谢通路, 且表达丰度最高。Sb04g034160基因GO 注释主要包括对硝酸盐的响应(GO:0010167)、硝酸盐转运(GO:0015706)、硝酸盐同化(GO:0042128)、细胞氮化合物合成(GO:0044271)、亚硝酸盐还原酶活性(GO:0050421)等, 表明Sb04g034160基因可能是通过调节NO3-无机氮同化基因的表达来实现。

Sb06g031460参与氮代谢(ko00910), 谷氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(ko00250), 氨基酸的生物合成(ko01230)等途径。Sb06g031460基因GO 注释主要包括谷氨酰胺合成(GO:0006542) 、 固氮(GO:0009399)、半胱氨酸合成(GO:0019344)、氨同化循环(GO:0019676)等, 差异表达基因KEGG 代谢通路分析结果与GO 富集分析具有较高的一致性。表明Sb06g031460基因可能通过调节NH4+有机同化基因的表达来实现。

3.4 低氮胁迫对光合作用的影响

氮素是作物光合器官及光合酶的构成部分, 土壤中的氮素供应对作物光合作用的正常运转起重要作用。植物内部的氮含量直接影响叶片扩展和光合作用[52]。正常生长条件下作物会将大部分吸收的氮向上运输到长势优良的叶片, 为其光合作用提供氮源, 从而增加CO2的同化; 而在低氮条件下, 作物光合作用一般会显著降低[53]。本研究低氮胁迫后, 参与光合作用(ko00195)的基因Sb01g006100表达下调。

4 结论

本研究在正常和低氮胁迫下, 通过对2 个耐低氮材料的转录组测序分析, 发现了苗期、抽穗期和开花期分别有246、371 和306 个基因在共同差异表达。其中, 3 个时期均差异表达基因28 个, 包括5 个上调表达基因和23 个下调表达基因; 对共同差异表达基因的KEGG 相关代谢通路富集分析, 发现主要集中在氮代谢、丙氨酸, 天冬氨酸和谷氨酸代谢、甘油磷脂代谢、氨基酸的生物合成等通路。该研究揭示了高粱响应低氮胁迫的转录组学变化, 为进一步发掘提高氮肥利用效率的优异基因奠定基础。