甘肃产不同品种松针的抗氧化活性研究

刘东彦 石晓峰,* 王 信 马趣环, 沈 薇

（1.甘肃省医学科学研究院，甘肃 兰州 730050；2.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000）

我国松树有10 个属120 余种，可供药用的达13 种。南方有丰富的马尾松（Pinus massonianaLamb.）、油松（P.abulacformisCarr.）、华山松（P.armandiFranch.）等，北方有白皮松（Pinus bungeanaZucc.ex Endl.）、雪松[Cedrus deodara( Roxb) G.Don] 、落叶松[Larix gmelinii(Rupr.) Kuzen].、樟子松(P.sylvestrisvar.mongolica Litv.)等，松树的利用价值很高[1-3]。松针，又称松叶、松毛，是松属植物的主要药用部位。松针的药用历史悠久，始载于《神农本草经》，被列为上品，称“松为仙人之食物”，表明松与长寿有关联。药王孙思邈创立了“服松子法、服松针法、服松脂法”等自然养生方法。《本草纲目》中记载“松柏为百木之长”，服之“令人不老、轻身益气，主风湿疮，生毛发，安五脏，守中，不饥延年”。梳理古医书记载不难发现，抗氧化、防衰老是松针久经实践并传承的传统医学功效之一。文献报道松针的提取物[4]及成分（总黄酮[4]、总多酚[5]和多糖[6]）具有较好的抗氧化活性，主要集中在马尾松[2,7-8]、雪松[9-11]、油松[5,12]、红松[5,13]、樟子松[4-5]、落叶松[4,14]等。

本文以甘肃产的6 种松树（兰州和天水）白皮松、雪松、油松、樟子松、落叶松及华山松为研究对象，收集4～5月份的各品种松针，使用不同浓度的乙醇对其进行提取，通过3 种体外抗氧化活性方法（DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力和铜离子还原能力）测试其提取物的抗氧化活性，并采用熵值法综合评价其抗氧化能力，遴选出抗氧化活性较强的松针资源，以期为进一步研究松针抗衰老药理学及开发松针天然抗氧化剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

DPPH·（1,1- 二苯代苦味酰基，批号：STBH7099），ABTS·[2,2'-连氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐，批号：SLBV6099]，美国Sigma公司。新亚铜灵（2,9-二甲基-1,10 菲啰啉，批号：20160307），国药集团化学试剂有限公司。没食子酸对照品（批号：110831-20083，含量＞95%），中国食品药品检定研究院。Vc（批号：20210818，含量＞99.8%），天津市科密欧化学试剂有限公司。其他试剂均为分析纯，水为纯净水。

甘肃产松树品种[15-16]主要有雪松、油松、华山松、白皮松、樟子松和落叶松。根据以往研究，选择在兰州和天水两市，同一地点、同一时间采集6 种松树。兰州雪松、白皮松、油松、华山松、樟子松及落叶松6 种松树于2021 年4 月19 日采自甘肃省兰州市植物园。天水雪松、白皮松、油松、华山松、樟子松及落叶松6 种松树于2021 年5 月8 号采自甘肃省天水市小陇山林业研究院。经品种鉴定后阴干，分别收集松针，粉碎后过药典二号筛。样品信息如表1 所示。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

1.2 试验仪器与设备

紫外分光光度仪（UV-1800），日本岛津公司。超声波提取仪（SK3310LHC），上海科导超声仪器有限公司。分析天平（AE260），瑞士Mettle公司。高速多功能粉碎机（CX-100），上海市晟喜制药机械有限公司。艾科浦超纯水机（AWL-0501-M），重庆颐样企业发展有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 供试品溶液制备

分别精密称取过药典二号筛的雪松、白皮松、落叶松、樟子松、油松和华山松各1.0 g，置于100 mL的锥形瓶中，并加入不同浓度乙醇（浓度分别为25%、40%、50%、60%、75%、100%）、水40 mL，浸泡20 min，超声提取60 min，连药渣定容至50 mL容量瓶中，待用。

1.3.2 DPPH自由基清除率测定[10]

精密量取各待测溶液1 mL，分别置于10 mL比色管中，加入DPPH·溶液3 mL（DPPH·浓度约为0.1 mmol/L），充分振摇，在室温避光下反应30 min，测定517 nm处的吸光度A。以无水乙醇加DPPH·溶液制备空白溶液，于517 nm处测定吸光度A0。按公式：DPPH自由基清除率=（A0-A）÷A0×100%，计算样品的DPPH自由基清除率。

1.3.3 ABTS自由基清除率测定[10]

精密量取各待测溶液1 mL，分别置于10 mL的比色管中，加入ABTS·溶液3 mL（ABTS·溶液临用前用无水乙醇稀释至吸光度为0.60±0.05），充分振摇，在室温避光下反应30 min，测定734 nm处的吸光度A。以无水乙醇加ABTS·溶液制备空白溶液，于734 nm处测定吸光度A0。按公式：ABTS自由基清除率=（A0-A）÷A0×100%，计算样品的ABTS自由基清除率。

1.3.4 铜离子还原能力法测定[17-18]

精密量取各待测溶液1 mL，分别置于10 mL比色管中，加入1 mL新亚铜灵，再加入氯化铜溶液1 mL，最后加入1 mL乙酸铵溶液即得反应液，避光条件下反应30 min。空白样同法测定。于450 nm波长处测定其吸光度。

精密吸取没食子酸对照品1.7 mg，用甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，配制浓度为68 μg/mL的对照品溶液备用。分别精密吸取没食子酸对照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成系列浓度的没食子酸对照品溶液。以吸光度值为纵坐标，没食子酸浓度（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程y＝0.079 2x-0.006 7（R2＝0.999 6）。结果显示，没食子酸浓度在0.68～13.6 μg/mL时，与吸光度呈良好的线性关系。

1.3.5 乙醇浓度筛选

取不同品种天水产松针的水提取物、25%乙醇提取物、50%乙醇提取物、75%乙醇提取物、无水乙醇提取物、40%乙醇提取物和60%乙醇提取物，将浓度稀释为400 μg/mL，测定其DPPH自由基清除率；将浓度稀释为80 μg/mL，测定其ABTS自由基清除率；将浓度稀释为160 μg/mL，以没食子酸当量（mg/g）评价其铜离子还原能力。

1.3.6 半数清除浓度（EC50）的测定

取不同品种松针的40%乙醇提取物和50%乙醇提取物，将浓度稀释成40、80、160、240、320、400 μg/mL的系列溶液，采用相同浓度的Vc作对照，测定其DPPH自由基清除率。将浓度稀释成8、16、32、48、64、80 μg/mL的系列溶液，采用相同浓度Vc作对照，测定其ABTS自由基清除率。采用 SPSS 19.0 统计软件logit回归分析，计算其DPPH自由基和ABTS自由基半数清除浓度（EC50）。

1.3.7 熵值法综合评价抗氧化活性

选用40%乙醇提取物和50%乙醇提取物的DPPH自由基清除率EC50值（A）、ABTS自由基清除率EC50值（B）和铜离子还原能力的没食子酸当量（C）为评价指标，其中EC50值越小，表示抗氧化活性越强，定义为负向指标；没食子酸当量值越大，表示铜离子的还原能力越强，其抗氧化活性就越强，定义为正向指标。将其数据导入SPSSPRO软件，对所选指标进行标准化数据处理，以计算不同品种松针的抗氧化活性综合评分。

2 结果与分析

2.1 乙醇浓度筛选结果分析

首先对浓度为400 μg/mL的不同品种天水产松针的水提取物、25%乙醇提取物、50%乙醇提取物、75%乙醇提取物、无水乙醇提取物的DPPH自由基清除率进行计算，结果如图1所示。由图可知，天水产松针中，25%和50%乙醇提取物的DPPH自由基清除活性较强，50%乙醇提取物的DPPH自由基清除活性略大于40%乙醇提取物。同时，对浓度为80 μg/mL松针提取物进行ABTS自由基清除活性测定，结果如图2所示。由图可知，天水产松针50%乙醇提取物的ABTS自由基清除活性略大于40%乙醇提取物。由图3所示不同提取物的铜离子还原能力可以看出，天水雪松松针40%乙醇提取物铜离子还原能力最强。然而，这3种抗氧化性能测试方法的结果并不一致，无法得出抗氧化活性最优的乙醇浓度，因而需进一步测定半数清除浓度（EC50）。

图1 不同浓度乙醇提取物的DPPH自由基清除活性Fig.1 The DPPH scavenging ability of extracts by different ethanol concentrations

图2 不同浓度乙醇提取物的ABTS自由基清除活性Fig.2 The ABTS scavenging ability of extracts by different ethanol concentrations

图3 不同浓度乙醇提取物的铜离子还原能力Fig.3 The CUPRAC ability of extracts by different ethanol concentrations

2.2 半数清除浓度（EC50）结果分析

测定系列浓度的不同品种、不同产地松针40%乙醇提取物和50%乙醇提取物的DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率，结果如图4和图5所示。通过SPSS 19.0软件计算EC50值，结果见表2。由数据可知，天水雪松松针40%乙醇提取物DPPH自由基清除率最强，但其50%乙醇提取物ABTS自由基清除率最强。

图5 最优浓度乙醇提取物的ABTS自由基的清除能力Fig.5 The ABTS scavenging ability of extracts by optimum ethanol concentrations

表2 熵值法数据表Tab.2 The data of entropy method

2.3 熵值法分析

熵值法是一种客观赋权方法，其根据各指标的变异程度，利用信息熵计算出各指标的熵值，再通过熵值对各指标权重进行修正，从而得出较为客观的指标权重。将3 种抗氧化方法测定数据按照熵值法的评价指标建立数据表，如表2 所示。将表2 数据导入SPSSPRO软件，计算得到甘肃产不同品种松针的抗氧化活性综合评分，结果如表3 所示。对比可知，雪松松针的抗氧化活性最好，且其40%乙醇提取物抗氧化活性最佳。

表3 熵值法评分结果Tab.3 The score result of entropy method

3 结论

体外抗氧化活性的评价方法较多，主要有化学分析法和细胞抗氧化活性法[19]，而化学分析法常被应用于天然药物抗氧化活性的初步研究[20-23]，尤其是自由基清除能力和还原能力的测定。本文结合课题组对紫斑牡丹花粉[18]和雪松松针[10]抗氧化活性的研究及预试验结果，最终选用DPPH、ABTS自由基清除法及铜离子还原能力法测定甘肃产不同品种、不同浓度乙醇的松针提取物的抗氧化活性。鉴于这3种抗氧化方法得出的结果不一致，因而选用熵值法对数据进行综合分析，得到不同品种、不同产地、不同浓度乙醇的松针提取物的综合评分。研究结果显示，雪松松针的抗氧化活性最好，其40%乙醇提取物的抗氧化活性最佳。这与课题组前期研究[10,24-26]中得到的40%乙醇、55%乙醇分别为雪松松针总黄酮、总多酚的最佳提取溶剂，及HPLC-DPPH法测得纯化后雪松松针总黄酮抗氧化活性高于其总多酚的结果一致。同时也表明，将熵值法用于不同体外抗氧化活性的综合评价可行。研究结果可为松针的进一步开发与应用奠定基础。