301例重度及极重度非综合征型耳聋患儿耳聋基因结果分析

侯小娟 杨 丽 丁 伟 刘 静 吴 梅

儿童听力残疾多以重度和极重度感音神经性聋居多[1]。耳聋病因中60%以上与遗传因素有关,在我国人群中耳聋基因变异主要来自于GJB2、SLC26A4、线粒体 12SrRNA及GJB3等4个热点基因[2]。目前针对新疆维吾尔自治区耳聋基因方面的检测工作大部分集中在GJB2(35delG、176 _ 191del16、235delC、299_300delAT)、SLC26A4(2168A>G,IVS7-2A>G)、mt12SrRNA(1494C>T,1555A>G)、GJB3(538C>T) 4个基因的9个位点上,而在非综合征型耳聋患者中这9个突变位点的检出率在18%左右,大部分非综合征型耳聋患者无法分析相关的耳聋致病基因,因此有必要增加耳聋基因突变位点的筛查,为更多的患者明确致病基因提供依据[3,4]。

对于重度和极重度耳聋患儿来说,遗传因素的差异也会影响人工耳蜗植入后的康复疗效,尤其在语前聋患者中, 基因突变是致聋的关键因素[5,6]。因此本研究将对重度及极重度非综合征型耳聋患儿的耳聋基因检测结果进行分析,可以更好的评估术后康复效果,为指导康复提供依据。

资料与方法

1.研究对象:收集2017～2019年在笔者医院耳鼻喉诊疗中心就诊的重度及极重度非综合征型耳聋患儿,对所有患者耳聋病史和用药史等进行详细询问并登记,排除耵聍栓塞、外伤、中耳疾病导致的听力下降以及综合征型耳聋,最终入选301例患儿。其中男性166例,女性135例,患儿平均年龄4.48±2.58岁。包含汉族51例,维吾尔族224例,哈萨克族20例,回族6例。遵循知情同意原则,收集所有患儿基本信息资料、听力学结果及耳聋基因检测结果。本研究通过新疆维吾尔自治区人民医院医学伦理学委员会审核通过(伦理学审批号:2017005)。

2.听力测试方法:所有听力检测项目均在隔声屏蔽室内进行。所有患者在检测前均采用电耳镜检查鼓膜及外耳道,清除外耳道耵聍。婴幼儿需自然入睡后或根据体重给予10%水合氯醛溶液口服入睡后方可进行听力学检测。声导抗测试采用Titan听力测试平台,1岁以上患者采用226Hz探测音,1岁以下采用226Hz和 1000Hz探测音;耳声发射采用CAPELLA诊断型耳声发射仪,采用畸变产物耳声发射(distortion product otoacoustic emission,DPOAE);听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)采用瑞索Neuro-Audio脑干诱发电位仪,交替短声刺激速率为21.1次/秒,分析时间为15ms,带通滤波(50～3000)kHz,叠加1024次,刺激声选用短声和短纯音(0.5kHz和1.0kHz),重复性佳的V波作为反应阈值。短声听性脑干反应(click-ABR)V波反应阈值≤30dBnHL为正常诊断标准。短纯音听性脑干反应(Tb-ABR) V波反应阈值≤40dBnHL为正常诊断标准。若患儿两耳听力损失程度不同时,以听力损失较轻耳来计算。听力损失分级标准(500、1000、2000、4000Hz平均值):轻度(26～40dBHL),中度(41～60dBHL),重度(61～80dBHL),极重度(≥81dBHL)。

3.耳聋基因检测:采集非综合征型耳聋患者的外周静脉血2ml于EDTA 抗凝管中,利用基因组提取试剂盒从患者全血中提取基因组DNA(内含线粒体DNA);以基因组DNA为模板利用所设计引物进行PCR 扩增、产物纯化和sanger测序工作(测序仪为3130DX),根据测序结果进行目标位点多态性的分析。检测位点包括GJB2:c.35delG、c.167delT、c.176_191del16、c.235delC、c.299_300delAT;SLC26A4:c.281C>T、c.589G>A、c.IVS7-2A>G、c.1174A>T、c.1226 G>A、c.1229C>T、c.IVS15+5G>A、c.1975G>C、c.2027T>A、c.2162C>T、c.2168A>G;mt12S rRNA:c.1494C>T、c.1555A>G、c.1585A>G、c.1047A>G、c.1095T>C、c.960_961insC/961delT;OTOF:c.4023G>A、c.4819C>T;SLC17A8:c.824C>A。

结 果

对301例就诊非综合征型耳聋患儿进行耳聋致病基因检测,共计筛查出阳性突变患者80例,总检出率为26.58%(80/301),其中纯合突变35例,杂合突变29例,复合杂合突变12例,双基因杂合突变4例。

GJB2基因总突变率为10.96%(37/301),主要突变形式为c.235delC,占突变人数的37.50%(30/80),其中纯合突变占突变人数的20.00%(16/80),携带杂合突变占突变人数的17.50%(14/80);其次突变率较高的为c.35delG,占突变人数的8.75%(7/80),其中纯合突变占突变人数的5.00%(4/80),携带杂合突变占突变人数的3.75%(3/80)SLC26A4基因总突变率为12.62%(38/301),主要突变形式为c.IVS7-2A,占突变人数的26.25%(21/80), 其中纯合突变占突变人数的2.50%(2/80),携带杂合突变占突变人数的23.75%(19/80)。其次突变率较高的为c.1174 A>T,占突变人数的11.25%(9/80),其中纯合突变占突变人数的2.50%(2/80),携带杂合突变占突变人数的8.75%(7/80)。

mt12SrRNA基因总突变率为4.32%(13/301)。主要突变形式为c.960_961insC/961delT,占突变人数的7.50%(6/80), 其中纯合突变占突变人数的5.00%(4/80),携带杂合突变占突变人数的2.50%(2/80)。同时还有c.1555A>G,占突变人数的5.00%(4/80), 其中纯合突变占突变人数的3.75%(3/80),携带杂合突变占突变人数的1.25%(1/80)。各突变位点在非综合征型耳聋患者中的检出情况如表1所示。

表1 301例重度及极重度非综合征型耳聋患者中耳聋基因突变位点汇总表

4例双基因杂合突变包括2例c.235delC/c.IVS7-2A>G突变;1例c.IVS7-2A>G/c.2027 T>A/c.960_961insC/961delT突变;1例c.235delC/c.1555A>G突变。1例c.1555A>G纯合突变患儿同时携带c.1226 G>A和c.2027 T>A杂合突变, 1例c.1585A>G纯合突变患儿同时携带c.2027 T>A杂合突变,1例c.960_961insC/961delT纯合突变患儿同时携带c.IVS7-2A>G 杂合突变;1例c.960_961insC/961delT纯合突变同时携带c.176_191del16杂合突变。未检测出OTOF中的c.4023G>A、c.4819C>T突变和SLC17A8中的c.824C>A突变。

将GJB2、SLC26A4、线粒体12SrRNA基因中各突变位点在汉族和维吾尔族中的分布情况进行比较,详见表2,汉族中突变位点的总检出率极显著高于维吾尔族(χ2=19.064、P<0.001)。在汉族和维吾尔族中突变频次最高的是235delC和 IVS7-2A>G位点,235delC位点(χ2=14.824、P<0.001)、IVS7-2A>G位点(χ2=11.225、P=0.003)和2168 A>G位点(P=0.006)在汉族中的分布极显著高于维吾尔族,两个民族其他突变位点比较,差异无统计学意义。

表2 各突变位点在汉族和维吾尔族中的检出情况[n(%)]

讨 论

本研究通过对301例重度和极重度非综合征型耳聋患儿进行耳聋基因筛查,阳性率达26.58%,与前期本地区检出情况比较检出比率有所提高,与增加了耳聋基因筛查位点有关[3,4]。其中GJB2、SLC26A4为主要的突变基因,突变率分别为10.96%和12.62%。由于哈萨克族和回族患儿样本量较少,笔者仅对汉族和维吾尔族患儿检测结果进行了对比,汉族中突变位点的总检出率极显著高于维吾尔族,由于这两个民族在常见耳聋基因的突变谱中差异很大,维吾尔族中可能存在其他突变热点,有待后续进一步研究[3]。

GJB2基因编码缝隙连接蛋白Cx26,并与相邻细胞的缝隙连接蛋白组成通道,是电解质、第二信使和代谢产物在细胞间转换的重要通道[7]。该基因的突变,会影响缝隙连接蛋白通道的正常开闭,使K+回流入内淋巴液的循环受阻,导致毛细胞的损伤,从而引起听力损失,GJB2突变的患者听力损失程度大多表现为重度或极重度耳聋[8]。GJB2相关性耳聋者的外毛细胞退化,血管纹发育不全,但螺旋神经节细胞的数量正常,因此CI术后能够获得满意听觉和言语康复效果具有理论基础以及实践经验,故明确的基因突变致聋对重度或极重度耳聋患耳的治疗和CI术后康复有重要意义[9,10]。GJB2突变的主要形式为c.235delC和c.35delG。刘海燕等[11]在对天津市重度和极重度非综合征型聋患儿常见耳聋基因筛查时发现GJB2突变的主要形式为c.235delC和c.299-300deiT,这种差别可能与新疆维吾尔自治区为少数民族聚居区有关。杨曦等[3]研究显示,新疆维吾尔自治区少数民族c.35delG的突变率较高。

SLC26A4 也是一种常见的遗传性耳聋基因,与前庭水管综合征和Pendred 综合征密切相关[12]。SLC26A4基因的突变会导致其编码的突变体蛋白不能到达细胞膜,而是停留在细胞内,使氯离子转运障碍,破坏内淋巴液平衡,引起液体储留在内淋巴囊以及骨质结构的破坏导致非综合征型聋[13]。本次研究中SLC26A4突变的主要形式为c.IVS7-2A和c.1174A>T,但以杂合突变的形式居多,需进一步进行SLC26A4测序来明确致病原因。关于SLC26A4 突变与CI 植入术后疗效相关性的研究结果也存在差异性[14,15]。后续本研究也将在扩大样本量的基础上进行深入研究。

mt12SrRNA基因是引起氨基糖苷类抗生素耳毒性和非综合征性聋的热点突变区域[16]。线粒体基因具有母系遗传特点,对突变携带者,指导其母系家庭成员安全用药,可在一定程度上避免或减缓聋病发生或发展,逐步降低药物性聋的发生率。mt12SrRNA主要突变形式为c.960_961insC/961delT和c.1555A>G,分别占突变人数的7.50%和5.00%。线粒体12SrRNA c.A1555G 突变在耳聋患者人群中的检出率有所降低,与耳毒性药物使用量降低有关。

本研究中就诊的患儿平均年龄为4.48±2.58岁,大部分为初次就诊,而在婴幼儿听力损失诊断与干预指南中要求筛查未通过的婴儿,应该在出生后3个月内接受全面的听力学及医学评估;确诊为永久性听力损失的婴儿均应该在6个月内尽快接受干预服务[17]。本研究中患者的平均确诊年龄与指南中要求有差距,因此提高听力筛查未通过婴幼儿的随访率、及早对听力损失患儿进行确诊和早期干预是我们新生儿听力筛查工作中的重点。同时开展耳聋基因筛查可以将患儿听力诊断时间缩短,更利于早发现、早干预[18]。对于重度及极重度耳聋患儿进行基因检测还可以更好地评估CI术后康复效果,为指导耳聋治疗及康复提供依据。