双重介导脑靶向脂质体增强荷载阿霉素的体外血-脑脊液屏障渗透率

黑 玉 梅 子 陈 阳 滕彬宏

血-脑脊液屏障(blood brain barrier, BBB),是由脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMVEC)及其细胞间紧密连接(tight junction, TJ)、毛细血管基膜以及嵌入其中的周细胞、星形胶质细胞和狭小的细胞外间隙共同组成的一个严密结构[1]。BBB作为一个生理性屏障,对物质的进入具有选择性,能够阻止大部分有害物质进入脑部,维持脑部内环境的稳定。但是同时BBB也限制了药物进入脑部发挥对于脑部疾病的治疗作用[2]。如何提高药物的BBB渗透率是脑部疾病治疗中有待于解决的关键问题。设计研发具有高BBB渗透率的新的药物分子十分困难。而高效的脑靶向药物递送系统,为提高现有治疗药物的BBB渗透率提供了可能[3]。

阿霉素(doxorubicin, DOX)是一种广谱的抗肿瘤治疗药物,目前在多种肿瘤的治疗中使用,包括乳腺癌、肺癌、急性粒细胞性白血病、前列腺癌等[4]。但是由于DOX的BBB渗透率较低,难以进入脑部,极大的限制了其在脑部肿瘤例如脑胶质瘤等治疗中发挥作用[5]。如何提高DOX的BBB渗透率,是其在脑部肿瘤治疗中所需要解决的重要问题。前期笔者利用脑靶向多肽RVGP以及细胞穿透肽(G2R9, R9)修饰空间稳定脂质体(sterically stabilized liposome, SSL),构建了双重介导(配体介导与吸附介导)的脑靶向脂质体(RVGPR9-SSL)[6～9]。RVGPR9-SSL有望通过双重介导作用,显著增强所荷载的药物的BBB渗透率,是非常有前景的脑部药物递送载体。为了探究RVGPR9-SSL对于DOX的递送能力,本研究将DOX包载在RVGPR9-SSL中(DOX@RVGPR9-SSL),在体外水平,初步考察了DOX@RVGPR9-SSL的BBB渗透率。此外,本研究创新性地采用荧光共振能量转移(fluorescence a resonance energy transfer, FRET)实验评价了跨越BBB后RVGPR9-SSL的完整性,并且对比研究了给药前后BBB的完整性,通过这两方面的研究对RVGPR9-SSL的安全性进行了充分考察。本研究通过体外BBB渗透率的考察以及安全性评价,为RVGPR9-SSL在脑靶向药物递送方面的应用提供了有力的数据支持,有望为脑部疾病的治疗提供创新性的策略。

材料与方法

1.试剂与仪器:高糖DMEM培养基与0.25%胰酶-EDTA均购自中科迈晨(北京)科技有限公司;胎牛血清购自美国Gibco公司;激光共聚焦小皿(35mm/20mm)购自北京华力德科技有限公司;Hoechst33342、DiO、DiI均购自北京中科科奥生物科技有限公司;BMVEC细胞由中日友好医院友情提供;Millicell-ERS EVOM2细胞电阻仪购自美国Millipore公司;荧光分光光度计购自美国瓦里安公司;细胞培养箱购自上海力申科技有限公司;涡旋振荡器购自海门其林贝尔仪器有限公司;超声波细胞破碎仪购自宁波新芝生物科技有限公司;流式细胞仪购自美国BD公司;SW-CJ-1B超净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司;TD4-WS离心机购自上海卢湘仪离心机仪器有限公司;激光共聚焦显微镜购自德国Leica公司。

2.DOX@RVGPR9-SSL制备:精密称取适量的 SPC、Chol、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-RVGPR9, 按照一定比例加入茄形瓶中(SPC∶Chol∶DSPE-PEG2000∶DSPE-PEG2000-RVGPR9=100∶50∶6∶2,mol/mol),用氯仿溶解,涡旋混匀,置于旋转蒸发仪上,于37℃水浴下旋干有机溶剂,直至在茄形瓶底部形成均匀的脂质薄膜,再持续抽真空30min,除去残存的有机溶剂。然后向茄形瓶中加入2ml pH 4.0的柠檬酸缓冲液(300mmol/L),置于涡旋振荡器上涡旋震荡,后置37℃的水浴中超声30min直至水化完全,获得载体RVGPR9-SSL脂质体。随后用0.5mol/L碳酸钠溶液调节脂质体pH至7.5～7.8。在50℃水浴预热下,加入DOX水溶液(DOX/SPC=1/20, w/w)搅拌30min,使脂质体充分包载DOX,即得到DOX@RVGPR9-SSL。之后柱分离法检测其包封率。

3.体外BBB模型构建与评价:体外培养BMVEC细胞,将培养瓶中融合至90%的BMVEC细胞,用专用培养基消化后,将BMVEC细胞以1×105个/孔的密度接种到Transwell上室中,之后将Transwell培养板转移到5% CO2、37℃孵箱中培养3～7天,直至BBB模型建立。培养过程中每两天更换1次培养基。通过扫描透射电镜(scanning transmission electron microscope, SEM)观察细胞间是否形成紧密连接,利用EVOM电阻测定仪检测Transwell上下室间的电阻值即TEER,并通过4h渗漏试验共同判断BBB模型是否建立成功。

4.RVGPR9-SSL完整性考察:为了方便考察跨越BBB后RVGPR9-SSL的完整性,在RVGPR9-SSL中包载了FRET对(DiO+DiI),分别制备了3种荧光脂质体DiO@RVGPR9-SSL、DiI@RVGPR9-SSL、(DiO+DiI)@RVGPR9-SSL。向已经成功构建体外BBB模型的Transwell培养板中各孔中加入这3种荧光脂质体,然后将Transwell培养板放于5% CO2、37℃孵箱中孵育4h。孵育结束后收集Transwell下室中的液体,利用激光共聚焦显微镜与荧光分光光度计进行检测。

5.DOX@RVGPR9-SSL给药后BBB完整性考察:在DOX@RVGPR9-SSL给药后,再次测量各孔跨膜电阻(transmembrane resistance value, TEER)值,观察孵育4h后药液的渗漏情况,并利用SEM观察细胞间的紧密连接,确定孵育4h后BBB的完整性。

结 果

1.DOX@RVGPR9-SSL的包封率:通过柱分离法检测DOX@RVGPR9-SSL(97.25%±0.60%)以及对照组DOX@SSL(96.79%±0.53%)的包封率。结果表明,脂质体的包封率均>95%,说明通过上述方法DOX可以成功地包载在脂质体中。

2.体外BBB模型评价:4h渗漏实验表明Transwell中液面差可维持0.5cm;利用EVOM电阻测定仪测定的TEER值>200Ω·cm2。通过SEM观察细胞状态(图1)可见BMVEC细胞排列致密,细胞间存在着明显的紧密连接。说明本研究中体外BBB模型成功建立,可用于后续研究考察。

3.RVGPR9-SSL完整性:为了方便检测RVGPR9-SSL跨越BBB后的完整性,笔者在RVGPR9-SSL中包载了FRET对(荧光探针DiO与DiI)。包载荧光探针的RVGPR9-SSL稀释至合适浓度后,与BMVEC细胞共孵育。BMVEC细胞对RVGPR-SSL的摄取的结果,如图2所示,DiO@RVGPR9-SSL摄取进入BMVEC细胞后呈现清晰的绿色荧光,DiI@RVGPR9-SSL摄取进入BMVEC细胞后呈现红色荧光,而混合包载两种荧光探针的脂质体(DiO+DiI)@RVGPR9-SSL摄取进入BMVEC细胞后呈现红色荧光增强,而绿色荧光几乎消失的现象,即FRET效应,这说明两种荧光探针共包载在RVGPR9-SSL中时距离<10nm[10]。将包载荧光探针的3种脂质体分别与构建的BBB模型进行孵育,孵育4h后,收集Transwell下室液体与BMVEC细胞共孵育,BMVEC细胞的摄取结果如图2所示,混合包载两种荧光探针的RVGPR9-SSL,仍然存在FRET现象,两种荧光探针的距离<10nm,说明脂质体在跨越BBB后仍然保持着较好的完整性。因此,以RVGPR9-SSL作为载体包载DOX,可以有效避免跨越BBB时因载体破裂而造成的DOX泄露,从而降低毒性不良反应。

在3种包载荧光探针的脂质体与BBB共孵育4h后,收集Transwell下室液体,用荧光分光光度计在相应的激发波长下进行荧光光谱扫描,结果如图3所示:共包载DiO与DiI的RVGPR9-SSL,存在着FRET效应,即供体DiO的荧光几乎消失,受体DiI的荧光增强,与激光共聚焦显微镜结果一致,说明两种双重介导脂质体跨BBB模型转运过程中,脂质体结构保持完整,未发生荧光探针的泄露。

图3 3种包载荧光探针的脂质体跨BBB后Transwell下室液体的荧光图谱

4.DOX@RVGPR9-SSL给药后BBB完整性:给药前BBB的形态如图1所示,BMVEC细胞间存在着明显的紧密连接。DOX@RVGPR9-SSL与BBB共孵育4h后,BBB的形态如图4所示。结果表明,在DOX@RVGPR9-SSL与BBB共孵育4h后,体外BBB模型仍然保持着较好的完整性,细胞间仍然存在着明显的紧密连接。4h渗漏实验表明,DOX@RVGPR9-SSL给药后,Transwell上下室可以维持0.5cm的液面差,同时TEER值>200Ω·cm2,也表明DOX@RVGPR9-SSL与BBB共孵育后,并未破坏BBB的结构,体外BBB模型在孵育过程中始终保持着较好的完整结构。这些结果说明DOX@RVGPR9-SSL具有较好的安全性,给药后不会影响BBB的完整性。

图4 DOX@RVGPR9-SSL孵育4h后BBB的形态图(×1500)

5. DOX@RVGPR9-SSL的 BBB渗透率:给药后0、1、2、3、4h分别取Transwell下室液体,按照上述实验方法测定DOX@RVGPR9-SSL的 BBB渗透率。以游离DOX以及普通脂质体组(DOX@SSL)作为对照组,结果如图5所示。游离DOX的4h累积BBB通透率仅为2.7%,DOX@SSL的4h累积BBB通透率仅为5.9%,而DOX@RVGPR9-SSL的4h累积BBB通透率为10.3%,较DOX组提高了3.8倍,DOX@SSL提高了1.7倍,表明该双重介导的脂质体作为载体,可以显著提高所包载DOX的BBB渗透率,并且DOX@RVGPR9-SSL的BBB渗透率显著高于DOX@SSL,说明双重介导的配体修饰可以显著增强脂质体跨BBB效率。综合上述结果,RVGPR9-SSL作为载体能够显著增强所包载药物的BBB渗透率,是极具前景的脑部药物递送载体。

图5 脂质体跨体外BBB模型的累积渗透率

讨 论

目前世界人口老龄化问题日趋严重,中枢神经系统的退行性病变、脑部肿瘤以及脑部炎症等疾病严重威胁着人类的健康[11]。DOX是一种广谱的抗肿瘤治疗药物,但是由于其BBB渗透率较低,难以进入脑部,极大限制了其在脑部肿瘤例如脑胶质瘤等治疗中发挥作用[5]。如何提高DOX的BBB渗透率,是其在脑部肿瘤治疗中所需要解决的重要问题。研究发现,普通长循环脂质体虽然可以增加DOX的BBB渗透率,但是效果并不理想[8]。针对这一问题,前期笔者利用脑靶向多肽RVGP以及细胞穿透肽(R9)修饰脂质体,构建了双重介导(配体介导与吸附介导)的脑靶向脂质体(RVGPR9-SSL)[6～8]。为了考察RVGPR9-SSL能否有效向脑部递送DOX,本研究在体外水平,初步对DOX@RVGPR9-SSL的BBB渗透率进行了考察。

在体外成功分离培养BMVEC的基础上,研究者构建了体外BBB模型,并不断发展和完善,为研究中枢神经系统疾病的发生、发展过程以及药物治疗提供了有力工具[12]。目前BBB模型包括BMVEC单层细胞模型、BMVEC与星形胶质细胞共培养模型、BMVEC、星形胶质细胞与周细胞共培养模型以及原代培养BMVEC细胞与周细胞共培养模型[13～16]。其中,BMVEC细胞单独培养模型,基本具备BBB的屏障功能,并且该模型构建方法比较简单,需要时间短,操作过程可重复,目前得到了广泛应用[17]。本研究构建了由BMVEC细胞单独培养而构建的BBB模型,并通过4h渗漏实验、SEM观察细胞间的紧密连接以及TEER的检测,确证了体外BBB模型成功构建,可以用于DOX@RVGPR9-SSL的BBB渗透率考察。

本研究发现,DOX@RVGPR9-SSL的BBB累积渗透率是游离DOX的3.8倍,是DOX@SSL的1.7倍,表明RVGPR9-SSL可以显著提高所包载DOX的BBB渗透率,是非常具有研究前景的脑靶向药物递送载体,并且通过FRET实验的结果,发现该脑靶向脂质体RVGPR9-SSL在跨越BBB后,可以保持较好的完整性,不会产生药物的泄露,具有较好的安全性。在DOX@RVGPR9-SSL跨越BBB后,BBB模型仍然可以保持较好的完整性,表明DOX@RVGPR9-SSL给药后不会破坏BBB的结构,也预示着其具有较好的安全性。

综上所述,本研究表明,前期构建的RVGPR9-SSL可以显著提高DOX的BBB渗透率,并且具有较好安全性,是非常具有前景的脑靶向药物递送载体,为DOX的脑部递送提供了新的策略。今后可以在体内水平上进一步研究其BBB渗透率以及脑内病灶部位的药物浓度,从而广泛应用于临床中。