冠心病患者血清lncRNA H19、CHAST的表达水平及临床意义

李 鹏 王 勋 韩翠敏 汪明琅 王怡练 孙黎明

心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)目前是我国居民病死率最高的疾病,作为一种常见的慢性心血管疾病,冠心病(coronary heart disease,CHD)是其中重要的疾病之一,近年来病死率也呈持续上升趋势,特别在农村地区尤为明显[1]。冠心病的根本原因是动脉粥样硬化,早期主要表现为内皮功能受损,而后巨噬细胞堆积、炎症及脂质分子参与,导致粥样斑块形成及肌层纤维化,最终引起管腔狭窄、阻塞,导致心肌缺血、缺氧。临床主要表现为心绞痛、心肌梗死甚至猝死等。血清长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一类与 mRNA 结构相近,但长度>200个核酸的 RNA 分子,由于其序列中开放阅读框的缺乏而不参与蛋白质编码,是广泛分布于各种生物中的多功能调节剂[2]。

近年来研究表明,多种lncRNAs参与动脉粥样硬化的形成[3]。其中人类母系印记基因lncRNA H19是较早发现的lncRNA之一,曾被报道其多态性与中国人群的CVD风险有关[4]。另外心肌肥大相关转录本lncRNA CHAST近年来亦被报道参与动脉粥样硬化形成的过程[5]。但lncRNA H19在急性、慢性冠状动脉综合征中的表达差异及lncRNA CHAST在冠心病中的具体表达情况未见有进一步的研究。因此本研究通过测定入组患者血清lncRNA H19、lncRNA CHAST相对表达水平,探讨lncRNA H19、lncRNA CHAST 在冠心病的发生、发展中的具体作用及其临床价值。

材料与方法

1.研究对象:选取 2021年6月～2022 年5月在笔者医院心血管内科住院患者共 197 例,分为 3 组,即急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)组76 例、慢性冠状动脉综合征(chronic coronary syndrome,CCS)组59例和对照组(control组)62例。纳入标准:冠心病患者均经冠状动脉造影显示至少1根主要心脏血管狭窄程度≥50%,ACS患者符合《急性冠状动脉综合征急诊快速诊疗指南(2019)》[6],包括ST段抬高型心肌梗死、非ST段抬高型心肌梗死和不稳定性心绞痛,CCS组患者符合2019年欧洲心脏病学会慢性冠状动脉综合征的诊断和管理指南,包括慢性稳定性劳力型心绞痛、缺血性心肌病及ACS之后稳定的病情阶段[7]。对照组均经冠状动脉造影排除冠心病。排除标准:①心脏瓣膜病、先天性心脏病、心力衰竭、血管痉挛性心绞痛、恶性心律失常;②严重感染、肝肾功能或其他重要器官衰竭;③系统疾病如血液病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤患者;④年龄小于 18 岁的患者,孕妇及哺乳期女性;⑤不自愿入组者以及病史资料不全者。本研究经笔者医院医学伦理学委员会批准(伦理学审批号:2022K005),所有入组患者均签署知情同意书。

2.观察指标:收集入组患者的一般临床资料,包括性别、年龄、身高、体重、吸烟史、饮酒史等。实验室指标:甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)、超敏C反应蛋白(high sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)、肿瘤坏死因子- α(tumor necrosis factor- α,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)以及lncRNA H19、lncRNA CHAST的相对表达水平。

3.主要仪器与试剂:实时荧光定量PCR仪(type:StepOnePlus),RNA提取试剂盒(RNAliquid blood RNA kit, RN23)购自北京艾德莱生物有限公司,反转录试剂盒(Fast King KT, KR116)、荧光定量试剂盒(FastFire qPCR preMix,FP207)试剂盒均购自天根生物科技有限公司,引物合成由通用生物科技有限公司完成。

4.标本采集:所有入组患者均于次日取平卧位抽取空腹外周静脉血4ml,放于EDTA抗凝管中,立即于温控离心机下4℃ 3000r/min 离心15min,离心后取上层清液置于1.5ml RNase EP管,-80℃下保存待用。

5.RNA提取及实时荧光定量:按照试剂盒说明书取0.25μl血清样本加入0.75μl裂解液混匀后按步骤提取总RNA,用Q9000分光光度仪测量其吸光度A值。按照反转录试剂盒说明书,各样本取1μg RNA,去除gDNA后,于20μl体系下42℃孵育15min,95℃孵育3min后置于冰上反转录为cDNA。两步法实时荧光(SYBR Green)定量分析,每个样本设3个复孔,参数为95℃ 1min预变性,95℃ 5s变性,60℃ 15s退火 40个循环。U6为内参基因,测量各个样本中lncRNA H19、lncRNA CHAST平均Ct值,采用2-ΔΔCt法计算其相对表达量。引物序列详见表1。

表1 各引物序列

结 果

1.各组患者一般资料及血清lncRNA H19、lncRNA CHAST表达水平比较:各组患者年龄、BMI、糖尿病史、饮酒史、TG、TC比较差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较,ACS组和CCS组性别、吸烟史、高血压史、LDL、HDL、hs-CRP、TNF-α、IL-6及血清lncRNA H19、lncRNA CHAST表达水平等指标存在显著性差异(P<0.05)。与CCS组比较,ACS组患者LDL、hs-CRP、TNF-α、IL-6及血清lncRNA H19、lncRNA CHAST表达水平显著升高(P<0.05),HDL表达水平降低(P<0.05),详见表2。

表2 各组资料比较

2.血清lncRNA H19和lncRNA CHAST表达水平诊断CHD的ROC曲线分析:血清lncRNA H19、lncRNA CHAST及联合诊断CHD的ROC曲线下面积(area under curve,AUC)分别为0.9025(95%CI:0.8607～0.9443)、0.7749(95%CI:0.7116～0.8383)和0.9299(95%CI:0.8948～0.9649),最佳截断值为1.29、1.56和0.98,特异性为75.6%、62.3%和73.3%,敏感度为88.7%、75.8%和93.5%,约登指数为0.643、0.477和0.668(图1)。

图1 lncRNA H19、lncRNA CHAST表达水平诊断CHD的ROC曲线

3.血清lncRNA H19 和lncRNA CHAST表达水平与其他指标的相关性:Pearson相关性分析表明CHD患者血清lncRNA H19、lncRNA CHAST表达水平与hs-CRP、IL-6、TNF-α、LDL呈正相关,与HDL呈负相关(P<0.05),详见表3。

表3 CHD患者血清H19、CHAST表达水平与其他指标的相关性

4.Logistic多因素回归分析CHD患者的危险因素:结果表明lncRNA H19、lncRNA CHAST、LDL、hs-CRP、吸烟、高血压均为CHD的独立危险因素(P<0.05),详见表4。

表4 Logistic多因素回归分析CHD危险因素

讨 论

近年来,冠心病的发生率呈逐年上升趋势,且发病年龄越来越趋于年轻化[1]。动脉粥样硬化是冠心病的根本原因,其源于内皮细胞损伤,并最终由炎症和免疫反应,脂质代谢,血管平滑肌的增殖和凋亡等机制共同参与形成动脉硬化斑块[8]。lncRNAs广泛分布于细胞核及胞质中,部分以外泌体等形式稳定存在于血浆中[9]。lncRNAs可介导多种信号转导途径,以及翻译程序和基因表达的转录后调控, lncRNA还可以与mRNA及蛋白质相互作用,调节蛋白质翻译后的修饰,这些作用大多是通过招募、信号、诱导、增强子及支架作用来实现的[10,11]。lncRNAs近年来被发现参与了冠心病形成的多个过程,如lncRNA Malat1可通过调节造血细胞的功能及促炎介质的表达进而影响脉粥样硬化[3,12]。

lncRNA H19位于人类染色体11p15.5上,曾有研究报道lncRNA H19水平升高与冠状动脉疾病的发病风险有关[13]。Tang等[14]研究发现,lncRNA H19亦可通过miR-152/VEGFA轴促进氧化型LDL(Ox-LDL)诱导的人主动脉内皮细胞功能障碍。而lncRNA CHAST位于人类7号染色体上,可由去氧肾上腺素、异丙肾上腺素以活化的T 细胞 (nuclear factor of activated T cell,NFAT)转导的核因子激活[15]。有研究表明,在早期心肌梗死患者血清中lncRNA CHAST表达水平升高[5]。以上研究均提示lncRNA H19与lncRNA CHAST可能与冠心病相关。本研究表明,冠心病患者血清lncRNA H19、lncRNA CHAST的表达水平较对照组明显升高(P< 0.05)。且ACS患者的lncRNA H19、lncRNA CHAST相较于CCS患者表达水平增高(P<0.05)。本研究显示,lcnRNA H19、lncRNA CHAST参与冠心病的发生、发展,这可能与其参与炎症、脂质代谢及内皮细胞功能障碍等因素相关。

ROC曲线分析结果表明,lncRNA H19、lncRNA CHAST对诊断冠心病有一定的价值。AUC分别为0.9025、0.7749。且两者联合诊断冠心病的AUC达到了0.9299,表明lncRNA H19、lncRNA CHAST联合对冠心病具有较好的诊断效能。高珩等[16]曾报道在冠心病患者中血清lncRNA H19表达升高,对诊断冠心病有一定的价值,本研究结果与之相似,且本研究表明lncRNA CHAST对冠心病也有同样的诊断价值。提示lncRNA H19、lncRNA CHAST或可作为诊断冠心病的血清标志物。

冠心病本质上是一种慢性炎症性疾病,炎性细胞因子贯穿动脉粥样硬化病变的整个过程。血管内皮细胞损伤后,LDL沉积在内皮下形成Ox-LDL,单核细胞在黏附因子和趋化因子的作用下聚集到内皮下分化形成巨噬细胞并吞噬大量的Ox-LDL 形成泡沫细胞[17]。同时产生大量的炎性细胞因子,引发一系列炎性反应,使得内皮损伤及趋化作用进一步加剧[18,19]。miRNA let-7是一种与炎症及脂质代谢相关的miRNA,可通过NF-κB/let-7/IL-6轴促进血管炎症的发展,有研究表明,lncRNA H19可通过调节NF-κB下调miRNA let-7来促进IL-6的表达[20],此外lncRNA H19还可以通过分子海绵作用直接靶向调节miRNA let-7促进炎性反应[21]。而lncRNA CHAST是自噬相关的lncRNA之一,冠心病患者心肌时常处于缺血状态,加重了心肌的自噬现象,进一步激活了机体的炎性状态,受损的自噬通量有助于炎症的激活[22]。此外,lncRNA CHAST表达调节的也可由NFAT信号激活,NFAT是一种具有多向调控功能的转录因子,受多种信号通路调节,参与血管壁相关细胞的增殖、迁移、血管生成和血管炎症[15, 22]。以上研究均支持lncRNA H19、lncRNA CHAST与炎性反应密切相关。

本研究结果表明,炎性细胞因子hs-CRP、IL-6、TNF-α以及LDL、HDL等指标在ACS组、CCS组及健康对照组间存在显著性差异。且 lncRNA H19、lncRNA CHAST表达水平与炎性细胞因子hs-CRP、IL-6、TNF-α以及LDL呈正相关,与HDL呈负相关。再次证明lncRNA H19、lncRNA CHAST与炎性反应密切相关,提示 lncRNA H19、lncRNA CHAST可能通过调节炎性细胞因子及脂蛋白的表达水平而影响冠心病的发展。将lncRNA H19、lncRNA CHAST、hs-CRP、IL-6、TNF-α、LDL、吸烟、高血压、性别等因素经Logistic多因素回归分析表明,lncRNA H19、lncRNA CHAST均为冠心病的独立危险因素。

综上所述,冠心病患者血清lncRNA H19、lncRNA CHAST表达水平较正常人升高,其中ACS患者血清表达水平高于CCS患者。lncRNA H19、lncRNA CHAST在冠心病患者中与hs-CRP、IL-6、TNF-α等炎性细胞因子及LDL的表达呈正相关,与HDL呈负相关,lncRNA H19、lncRNA CHAST是冠心病的独立危险因素,并可作为诊断冠心病的血清标志物,可能成为未来基因治疗的靶点。