KIF11、β-catenin、GSK-3β在宫颈癌中的表达及临床意义

张晓静 经 莉 魏 敏 陆晓媛

宫颈癌发生率居于妇科恶性肿瘤首位,发生机制仍不明确,从分子水平角度对宫颈癌的发生、发展进行研究更易于明确宫颈正常组织恶变过程,对于临床有效治疗宫颈癌意义重大。Kinesin家族成员11(kinesin family member 11, KIF11)是有丝分裂中必需的分子运动蛋白,促进细胞有丝分裂双极纺锤体形成,并在间期介导细胞质的各种运输过程[1]。研究表明,KIF11是一种Wnt相关蛋白。Pei等[2]研究发现,KIF11可通过激活Wnt/β-catenin信号通路增强乳腺癌细胞的自我更新,从而增强乳腺癌干细胞的特性。Wu等[3]研究发现,KIF11通过调节Wnt/β-catenin信号通路的活性促进肝细胞癌的恶性进展。β-catenin、GSK-3β作为此通路的主要调控因子发挥着重要作用。对于KIF11是否通过Wnt/β-catenin通路在宫颈癌中发挥作用,相关报道较少。本研究利用免疫组化法初步探究KIF11与Wnt/β-catenin信号通路相关分子在宫颈癌中的表达及临床意义,旨在探讨三者联合检测对于宫颈癌诊断的临床价值及潜在的治疗靶点。

资料与方法

1.一般资料:收集2013年12月～2017年5月在徐州医科大学附属医院病理科存档的宫颈组织蜡块。标本中宫颈癌患者102例,患者年龄26～69岁,中位年龄为48岁。年龄<50岁55例,≥50岁47例;病理类型为鳞癌86例,腺癌16例;根据国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics, FIGO)分期,FIGO Ⅰ期69例,Ⅱ期24例,Ⅲ期9例;分化程度为高分化66例,中、低分化36例;无淋巴结转移53例,有淋巴结转移30例(102例宫颈癌患者中,83例接受了手术治疗,术中行淋巴结清扫术;19例患者接受了放化疗等抗肿瘤治疗)。同期收集慢性宫颈炎组织40例,患者年龄30～58岁,中位年龄为46岁。低级别鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion, LSIL)组织46例,高级别鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL)组织52例,患者年龄28～55岁,中位年龄为45岁。宫颈癌患者纳入标准:①病理确诊为宫颈癌;②临床病理资料完整;③患者可进行术后长期随访。排除标准:①合并其他系统的恶性肿瘤;②合并其他内外科疾病。本研究经徐州医科大学附属医院医学伦理学委员会批准(伦理学审批号:XYFY2022-KL224),样本收集取得患者知情同意。

2.主要试剂与仪器:兔抗人多克隆抗体KIF11购自北京博奥森生物技术有限公司,兔抗人多克隆抗体β-catenin、兔抗人多克隆抗体GSK-3β均购自武汉赛维尔生物科技有限公司,组化笔、试剂盒及二氨基联苯胺(3,3′-diaminobenzidine,DAB)显色剂购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

3.实验方法:采用免疫组化法检测KIF11、β-catenin、GSK-3β在不同宫颈组织中的表达情况,具体实验操作步骤如下:将组织蜡块4μm厚度连续切片;切片脱腊至水化;枸橼酸抗原修复缓冲液(pH 6.0)进行抗原修复;切片放入3%过氧化氢溶液,室温避光孵育25min,以阻断内源性过氧化物酶活性;膜封闭液(3%BSA)中封闭30min;滴加KIF11、β-catenin、GSK-3β一抗,4℃孵育过夜;滴加二抗,室温孵育50min;DAB显色;苏木精复染细胞核3min;脱水封片;显微镜镜检,图像采集分析。

4.结果判定:病理切片由两名高年资病理科医师采用双盲法进行阅片。在高倍镜(×400)下随机选取10个视野,每个视野观察100个细胞。染色强度评分如下:无着色记为0分,淡黄色记为1分,棕黄色记为2分,棕褐色记为3分。阳性细胞百分比评分如下:阳性细胞<5%记为0分,5%～25%记为1分,25%～50%记为2分,50%～75%记为3分,≥75%为4分,根据染色强度×阳性细胞百分比的结果作为最终得分:<3分判为阴性,≥3分判为阳性。

5.随访:对所有患者进行长期随访,采用门诊复诊、电话等方式随访患者的生存状况,以患者开始治疗的时间作为随访开始时间,随访时间截至2022年7月31日。

6.统计学方法:应用SPSS 26.0统计学软件对数据进行统计分析。采用χ2检验分析不同宫颈组织中KIF11、β-catenin、GSK-3β的表达情况及其与宫颈癌临床病理特征的关系,采用Spearman相关分析法分析KIF11、β-catenin与GSK-3β三者之间的相关性,采用Kaplan-Meier法对宫颈癌患者进行生存分析,COX比例风险模型分析影响宫颈癌患者的独立预后因素,以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.不同宫颈组织中KIF11、β-catenin、GSK-3β表达情况:KIF11在细胞质中以棕褐色颗粒形式表达,阳性率在慢性宫颈炎组、LSIL组、HSIL组和宫颈癌组分别为12.50%、32.60%、44.23%、60.78%,呈逐渐递增趋势;β-catenin在细胞质和细胞核中以棕黄色颗粒形式表达,阳性率在4组中分别为15.00%、28.26%、48.08%、62.75%,呈逐渐递增趋势;GSK-3β在细胞质和细胞核中以棕黄色颗粒形式表达,阳性率在4组中分别为67.50%、47.83%、36.54%、24.51%,呈逐渐递减趋势(P<0.05),详见表1。

表1 不同宫颈组织中KIF11、β-catenin、GSK-3β阳性率比较[n(%)]

2. KIF11、β-catenin、GSK-3β表达情况与宫颈癌患者临床病理特征的关系:在宫颈癌患者组织中,KIF11、β-catenin、GSK-3β阳性表达在FIGO分期、分化程度、淋巴结转移方面比较,差异均有统计学意义(P<0.05),在不同年龄及病理类型方面比较,差异无统计学意义(P>0.05),详见表2。

表2 宫颈癌组织中KIF11、β-catenin、GSK-3β表达与临床病理特征的关系(n)

3. 宫颈癌组织中KIF11、β-catenin、GSK-3β表达相关性分析:在宫颈癌组织中,KIF11与β-catenin的表达水平呈正相关(r=0.461,P<0.05),β-catenin与GSK-3β的表达水平呈负相关(r=-0.692,P<0.05),KIF11与GSK-3β的表达水平呈负相关(r=-0.336,P<0.05)。

4. KIF11、β-catenin、GSK-3β的表达与宫颈癌患者预后的关系:对102例宫颈癌患者进行长期随访,其中失访患者15例,死亡患者20例,随访率为85.30%。Kaplan-Meier生存分析曲线显示,KIF11阳性表达患者的平均生存时间短于阴性表达患者,β-catenin阳性表达患者的平均生存时间短于阴性表达患者,GSK-3β阳性表达患者的平均生存时间长于阴性表达患者(P<0.05),详见图1～图3。

图1 KIF11阳性和阴性宫颈癌患者生存曲线

图2 β-catenin阳性和阴性宫颈癌患者生存曲线

图3 GSK-3β阳性和阴性宫颈癌患者生存曲线

5.影响宫颈癌患者预后的单因素及多因素分析:单因素分析结果显示,FIGO分期、组织分化程度、淋巴结转移、KIF11、β-catenin和GSK-3β的表达与患者预后相关(P<0.05)。多因素分析结果显示,FIGO分期、淋巴结转移、KIF11、β-catenin为宫颈癌患者预后的独立危险因素,GSK-3β为独立保护因素,详见表3。

表3 COX回归分析宫颈癌患者的预后影响因素

讨 论

正常宫颈组织到恶变是一个受多因素调控的复杂过程。Wnt/β-catenin信号通路是调节肿瘤侵袭和转移的关键通路[4]。Wnt/β-连环蛋白信号转导途径由细胞外Wnts启动,并通过配体与细胞膜上存在的各种受体和辅受体结合转导,激活细胞内转录或非转录反应[5]。研究表明,Wnt信号通路在宫颈癌的发生和侵袭中具有重要作用[6]。已有相关研究表明,KIF11可以调控Wnt/β-catenin信号通路[2,3]。

KIF11是一种高度保守的运动蛋白,其结构域通过将ATP的化学能转化为机械力来结合并跨越微管[1]。由于KIF蛋白(如KIF11)的过表达,在有丝分裂过程中产生额外的力,导致姐妹染色单体过早分离,染色体分布不均,进一步导致子代细胞的非整倍性[7]。有研究发现,KIF11在有丝分裂期间的G2/M期转变和细胞周期检查点中发挥重要作用,随后调节肿瘤进展[8]。鉴于此,收集宫颈癌患者组织中KIF11蛋白表达情况并进行相关研究具有重要意义。Cheng等[9]研究发现,KIF11在宫颈癌中表达增加,并且在宫颈癌进展过程中KIF11介导了胞质分裂。

本研究中,随着宫颈病变进展,KIF11阳性率呈上升趋势,推测KIF11高表达预示宫颈癌组织恶化进程。此外,KIF11阳性患者生存时间低于阴性患者,认为KIF11在宫颈癌中充当癌基因,与患者预后不良相关。众所周知,HPV感染是宫颈癌的危险因素。研究表明,HPV相关性宫颈癌的发病机制与病毒癌蛋白E6和E7的高表达相关,通过抑制多种细胞蛋白(如p53、pRb、p21和p27),从而影响细胞增殖、细胞周期和凋亡等生物学过程[9]。由此可见,HPV和KIF11均可通过影响细胞增殖及细胞周期过程参与宫颈癌的发生、发展,且两者表现为协同作用,均是宫颈组织恶变的危险因素。

β-catenin是Wnt信号通路中重要的蛋白质分子,其在宫颈癌组织中的表达水平直接影响Wnt/β-catenin信号通路的激活程度。β-catenin主要涉及两种细胞活动:细胞-细胞黏附和信号转导[10]。研究表明,HPV16 E6激活Wnt/β-catenin通路,对HPV转化、上皮细胞永生、平衡组织稳态和病理表型至关重要[11]。本研究中,随着宫颈病变进展,β-catenin阳性率上升,表明β-catenin高表达预示宫颈癌的发生。本研究将患者按照β-catenin表达情况进行分组发现,β-catenin阳性患者生存时间显著低于阴性患者,这与相关研究认为HPV可通过诱导Wnt/β-catenin通路活化并促进宫颈癌恶性进展的结论具有相似之处,由此认为β-catenin在宫颈癌中充当癌基因作用,并影响患者预后[12]。Bulut等[13]研究发现,在双转基因小鼠模型中,HPV16 E7和组成型活性β-catenin的共表达可加速宫颈癌的发生。Wnt/β-catenin通路参与HPV相关性宫颈癌的发生,且β-catenin高表达可与HPV共同参与宫颈癌患者的癌变过程。

GSK-3β作为一种细胞内丝氨酸-苏氨酸激酶,其活性可以通过底物特异性的方式调节[14]。磷酸化作为GSK-3β最重要的调控机制,可影响参与DNA修复的相关信号通路的因子,以促进DNA修复。在DNA损伤的研究中,细胞核和线粒体中GSK-3β的不断激活促进肿瘤抑制蛋白p53的表达,并与p53形成复合物,增强p53诱导的凋亡反应[15]。作为β-连环蛋白的上游基因,GSK-3β通过控制Wnt信号转导,在细胞增殖、迁移、转移和分化中担负重要作用[17]。在不同类型的肿瘤中,GSK-3β作为肿瘤抑制因子或肿瘤启动因子仍具有争议[16]。

本研究发现,随着宫颈病变进展,GSK-3β阳性率减低,这可能与GSK-3β异常表达通过使细胞内代谢调控异常、延缓组织恶化过程有关。Abudula等[17]研究发现,宫颈癌发生及HPV感染伴有肿瘤组织内糖脂和氨基酸分解代谢加剧,能量代谢增强,处于物质代谢紊乱的病理状态,与HPV阴性对照比较,GSK-3β在HPV16阳性宫颈癌或癌前病变中表达减少,由此认为,通过影响GSK-3β表达参与宫颈组织病变过程,可能是HPV促进宫颈癌发生的重要因素之一。此外,GSK-3β阳性患者生存时间高于阴性患者,推测GSK-3β可能在宫颈癌中充当抑癌基因作用,在临床病例中此类患者预后更好。

本研究中宫颈癌患者组织中KIF11、β-catenin、GSK-3β阳性表达显著影响FIGO分期、分化程度、淋巴结转移,而不受年龄及病理类型影响,三者不仅在宫颈组织向恶化转变过程中担负重要作用,而且有助于评估肿瘤恶性程度进展及预后;其中KIF11及β-catenin阳性表达互为影响,两者共同参与宫颈癌的发生、发展,在宫颈组织恶变进程中发挥协同作用,GSK-3β分别与KIF11、β-catenin起相互抑制作用,在宫颈癌中发挥负性作用,推测三者可作为宫颈癌的有效预测指标。β-catenin、GSK-3β作为Wnt信号通路的重要分子,KIF11可能通过激活该信号通路来调控宫颈癌的恶性进展。但本研究受研究样本量限制,且为单中心研究,今后将收集更大样本量,采用多中心研究予以验证本实验结论。

综上所述,KIF11、β-catenin与GSK-3β异常表达与宫颈癌的发生、发展及预后相关,三者联合检测为宫颈癌的诊断及预后提供了新的参考。