基于指纹图谱、多指标定量和网络药理学的蓍草质量标志物预测分析

王超，付瑞嘉，徐顶巧，陈艳琰，乐世俊，唐于平

（陕西中医药大学 陕西省中医药管理局中药配伍重点研究室，陕西 西安 712046）

蓍草是菊科（Asteraceae）植物蓍（Achillea alpinaL.）的干燥地上部分，具有解毒利湿、活血化瘀的功效［1］。现代药理研究表明蓍草具有抗菌、抗炎、解热镇痛的作用［2］。2020版《中国药典》中以绿原酸作为蓍草的质控成分并进行含量测定，但是单一成分难以实现对中药整体质量的全面控制。为提升完善中药质量标准体系，刘昌孝院士提出中药质量标志物（Quality maker，Q-Marker）。该理论将中药有效性-物质基础-质量控制标志性成分相关联，能够综合评价中药质量，目前已被用于中药材及其复方的Q-Marker研究［3-4］。中药指纹图谱能在中药含有的化学成分模糊不清的情况下，从整体上准确地描述中药及其制剂质量的真实性、稳定性和均一性［5］。网络药理学能够从靶点和通路的角度阐述药材的生物活性［6］，被广泛应用于单味药及复方药治疗疾病作用机制的预测和中药材Q-Marker的挖掘［7］。

基于中药质量标志物理论，从化学成分的有效性及可测性分析发现，蓍草中的绿原酸类化合物是奎尼酸和咖啡酸的缩酚类化合物，属于有机酸类。研究表明其具有抗炎、抗菌、抗氧化和抗病毒等药理作用［8-9］。肖萌等［10］采用HPLC法对蓍草有机酸类成分（绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C）进行检测分析后发现，蓍草中绿原酸类成分丰富且不同采收时期的含量差异明显。从传统药性药效分析发现，苦味药的物质基础多为生物碱、黄酮苷类及皂苷类成分，酸味药的物质基础多为有机酸类成分［11-12］。现代研究认为，苦能清热解毒，下气平喘，具有抗菌和抗感染的作用；酸能收敛固涩，安蛔止痛，具有抗菌消炎、止血止泻的作用［13］。历代古籍和2020版《中国药典》记载蓍草味苦、酸，性平，具有解毒利湿、活血止痛的功效，可用于治疗乳蛾咽痛、泄泻痢疾、肠痈腹痛、热淋涩痛等。据此推测有机酸类及黄酮苷类成分属于蓍草药性的物质基础之一。综上所述，有机酸类及黄酮苷类成分在蓍草中含量丰富可测且与蓍草功效紧密相关，符合质量标志物筛选原则，故本研究结合网络药理学与指纹图谱探究蓍草的潜在Q-maker，为蓍草质量标准的提升和全程质量控制提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

Waters 2695型高效液相色谱仪，配套2998 PDA Delector光电二极管矩阵检测器（上海沃特世科技有限公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Mili-Q IQ7000型超纯水系统（德国默克密理博公司）；梅特勒MS105DU电子分析天平、梅特勒ME204电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 试剂

绿原酸对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：Y20A11K111541）、异绿原酸A（成都洛克玛生物科技有限公司，批号：CHB180921）、异绿原酸B（成都德理特生物技术有限公司，批号：DST191008-037）、异绿原酸C（成都德理特生物技术有限公司，批号：DSTDY003801）；百蕊草素Ⅱ和3，4，5-三咖啡酰奎宁酸由实验室自制，经液相色谱测定纯度 ≥98%；超纯水；色谱纯甲醇（霍尼韦尔国际公司）。

1.3 蓍草药材

本研究所用蓍草药材均购自铜陵禾田中药饮片股份有限公司，药材采摘时间为6 ～ 8月份，经陕西中医药大学颜永刚教授鉴定为菊科植物蓍草的干燥全草。21批蓍草相关信息见表1。

表1 21批蓍草药材批次与来源产地Tab. 1 21 batches of A. alpina herbs batches and sources of origin

1.4 蓍草HPLC指纹图谱建立及相似度分析

1.4.1 蓍草色谱洗脱条件

采用XSelect®HSS T3 C18色谱柱；流动相为甲醇（A） - 0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱，0 ～ 4 min，10% ～ 32% A； 4 ～ 12 min， 32% ～ 36% A； 12 ～ 39 min，36% ～ 37 A%； 39 ～ 54 min， 37% ～ 67% A； 54 ～ 60 min，67% ～ 90% A； 60 ～ 63 min， 90% ～ 10% A； 63 ～ 66 min，10% A；检测波长为260 nm；流速为1.0 mL/min；柱温为35℃；进样量为10 μL。

1.4.2 对照品溶液制备

取绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、百蕊草素Ⅱ和3，4，5-三咖啡酰奎宁酸对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制备成单一对照品储备溶液；精密量取上述储备溶液适量，混合后加甲醇稀释，最终制成每1 mL含绿原酸0.5 mg、异绿原酸B 0.8 mg、异绿原酸A 0.8 mg、异绿原酸C 0.5 mg、百蕊草素Ⅱ 0.5 mg、3，4，5-三咖啡酰奎宁酸 0.5 mg的对照品溶液。

1.4.3 供试品溶液制备

取蓍草药材（过2号筛）约2 g，置于具塞锥形瓶中，加入70%甲醇40 mL，密塞，称定质量，40℃水浴，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）45 min，放冷，再次称定重量，用70%甲醇补足损失量，摇匀，抽滤，取续滤液，即得供试品溶液。

1.4.4 方法学考察

1.4.4.1 精密度试验

取S5批次蓍草药材，按“1.4.3”项方法制备供试品溶液，按“1.4.1”项下色谱条件连续进样6次，以绿原酸峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差（RSD）。

1.4.4.2 重复性试验

取S4批次蓍草药材，按“1.4.3”项方法平行制备6份供试品溶液。按“1.4.1”项下色谱条件连续进样，以绿原酸峰为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。

1.4.4.3 稳定性试验

取S5批次蓍草药材，按“1.4.3”项方法制备供试品溶液，按“1.4.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、12、16、24 h后进样，以绿原酸峰为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。

1.4.4.4 线性关系考察

取“1.4.2”项下制得的混合对照品溶液，加入甲醇逐级稀释，按“1.4.1”项下色谱条件进行测定。以质量浓度为横坐标（x），以峰面积为纵坐标（y）进行线性分析。

1.5 样品含量测定

精密称取21批次蓍草粉末，按“1.4.3”项方法制备供试品溶液，按“1.4.1”项下色谱条件测定蓍草供试品溶液，平行测定3次，依据线性方程计算蓍草中各成分的质量分数。

1.6 指纹图谱的建立与相似度分析

按“1.4.2”项下方法制备21批蓍草供试品溶液，按“1.4.1”项下色谱条件进样，分别记录其HPLC色谱图。采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）对蓍草指纹图谱进行全谱峰匹配，设定时间宽度为0.1，以S1药材HPLC色谱图作为参照图谱，采用中位数法，时间窗口设置为0.2，并标定共有峰以获取蓍草指纹图谱。采用标准品色谱对照方法对蓍草的峰进行峰归属，并使用软件对21批蓍草指纹图谱进行相似度评价。

1.7 多元统计学分析

使用SIMCA软件对蓍草中13个共有峰进行偏最小二乘回归（OPLS-DA）分析以筛选不同产地间蓍草的差异标志物。

1.8 网络药理学分析

1.8.1 候选化合物靶点预测

为进一步判断各成分与蓍草传统的相关程度，采用网络药理学的方法进行筛选分析。将相关成分的英文名输入TCMSP数据库和比较毒物基因组学数据库CTD（http://ctdbase.org/） 获取其作用靶点。对于靶点较少的关键成分用分子相似性集合方法Similarity Ensemble Approach数据库 （http://sea.bkslab.org/） 预测其可能作用的靶标点，最后汇总所有数据库得到的靶点，并使用蛋白质信息数据库Uniprot （https://www.uniprot.org/），将所有靶点名称标准化。

1.8.2 靶点蛋白互作网络分析

将相关成分潜在作用靶点导入STRING 数据库（https://string-db.org/），构建蛋白质相互作用网络，限定物种为“Homo sapiens”，蛋白互作评分设定为最低不小于0.4，删除与其他蛋白无相互作用的蛋白，得到蛋白互作关系。

1.8.3 GO功能及KEGG通路富集分析

将相关成分作用靶点输入DAVID （https://david.ncifcrf.gov/） 数据库中，设置物种为“Homo sapiens”，进行GO （Gene ontology） 功能富集分析及KEGG （Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路分析。

1.8.4 “成分-靶点-通路”网络构建与分析

将6个活性成分，34个靶点及20条通路间的关系，运用Cytoscape 3.8.2软件构建网络关系图并通过拓扑分析筛选蓍草的关键活性成分。

1.8.5 分子对接

将“1.8.4”项下得到的关键活性成分与度值大于50的8个核心靶点进行分子对接，验证成分与靶点间的结合活性。从ZINC数据库中下载成分的3D分子结构，在PDB数据库中下载核心靶点的蛋白分子结构文件，限定物种为“Homo spaiens”，使用AutoDock vina软件将分子与靶点进行对接，得到它们之间的结合能以及对接的PDBQT文件。选取结合能最低的6个PDBQT文件导入Pymol软件中进行可视化。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

精密度试验结果表明，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差（RSD）均小于1%，表明仪器精密度良好。重复性试验结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD值小于1%，相对峰面积的RSD值小于5%，表明该方法具有良好的重复性。稳定性试验结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD值小于1%，相对峰面积的RSD值小于2%，表明供试品在制备后24 h内稳定。各成分线性考察结果表明各成分在线性范围内具有良好的线性关系，见表2。

表2 线性回归方程Tab. 2 Linear regression equations

2.2 蓍草中成分含量

通过各成分的线性曲线，分析测定得到了21批次药材中绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、百蕊草素Ⅱ和3，4，5-三咖啡酰奎宁酸成分含量，结果见表3。

表3 21批蓍草药材中成分的含量Tab. 3 Content of components in 21 batches of A. alpina herbs

2.3 指纹图谱的建立与相似度分析

通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析得到蓍草的指纹图谱，见图1。采用标准品色谱对照方法，共指认出6个峰，分别为绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、百蕊草素Ⅱ和3，4，5-三咖啡酰奎宁酸（图2）。蓍草混合对照品图谱及蓍草药液色谱图见图3。相似度评价分析表明，蓍草指纹图谱相似度在0.910 ～ 0.990，见表4。结果说明不同产地蓍草指纹图谱相似度较高，药材质量均一稳定。

图1 21批蓍草药材指纹图谱Fig.1 Fingerprints of 21 batches of A. alpina herbs

图2 化合物结构Fig.2 Compound structures

图3 混合对照品溶液、蓍草提取液、峰10和峰13色谱图Fig.3 Chromatogram of mixed control solution， A. alpina extract， peak 10 and peak 13

表4 21批次蓍草指纹图谱相似度Tab. 4 Similarity of fingerprint profiles of 21 batches of A.alpina

2.4 多元统计分析

得分矩阵图与变量重要性投影图，见图4和图5。模型拟合参数R2X= 0.953，R2Y= 0.705，模型预测参数Q2= 0.543，表明该模型拟合良好。图4显示，不同产地的蓍草药材各自聚为一类，表明不同产地的蓍草药材成分含量间存在差异。为了寻找引起各批次蓍草药材质量差异的成分，采用VIP（Variable importance in the projection）值正态分布图筛选出5个VIP值大于1的成分，分别为1号峰，10号峰：百蕊草素Ⅱ，3号峰，13号峰：3，4，5-三咖啡酰奎宁酸，4号峰。这些成分使得不同产地之间蓍草可以区分开，属于蓍草的差异性标志物。

图4 OPLS-DA图Fig.4 OPLS-DA diagram

图5 VIP得分图Fig.5 VIP score chart

2.5 网络药理学研究

2.5.1 候选化合物靶点预测

HPLC法共指认出6个成分，其中绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、3，4，5-三咖啡酰奎宁酸属于有机酸类成分，百蕊草素Ⅱ属于黄酮苷类成分，经多元统计分析后，初步认为可以将绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、百蕊草素Ⅱ和3，4，5-三咖啡酰奎宁酸这6个成分作为蓍草质量标志物的候选成分。同时，OPLS-DA分析表明百蕊草素Ⅱ和3，4，5-三咖啡酰奎宁酸这2个成分属于蓍草中的差异性成分，对于蓍草的质量控制具有重要作用。故这些成分被作为研究对象，共筛选得到与6个成分相关的靶点共107个。

2.5.2 靶点蛋白互作网络分析

蛋白相互作用网络见图6。将网络数据导入Cytoscape 3.8.2软件进行网络拓扑分析，以各个节点的连接度（Degree），介度（Betweenness）及紧密度（Closeness）均大于其中位数为筛选条件，共得到38个核心靶点，其中度值大于50的靶点共8个，分别为肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor， TNF，degree = 68）、血清白蛋白（Albumin， ALB， degree = 66）、白细胞介素6（Interleukin-6， IL6， degree = 65）、白细胞介素1B（Interleukin-1B， IL1B，degree = 58）、胱天蛋白酶3（Caspase-3， CASP3，degree = 57）、jun激酶（Jun kinase， JUN， degree =54）、β-连环蛋白1（Catenin beta 1，CTNNB1， degree = 51），基质金属蛋白酶9（Matrix metallopro-teinase 9， MMP9， degree = 51）。

图6 PPI网络图Fig.6 PPI network diagram

2.5.3 GO功能及KEGG通路富集分析

GO生物富集分析共得到554条相关生物过程，其中生物过程 （Biological process， BP）相关424条，细胞组分 （Cellular component， CC） 相关54 条以及分子功能 （Molecular function，MF）相关76条。选取P＜ 0.05，排名前10的富集结果进行可视化，见图7。分析结果显示，BP主要涉及脂多糖介导反应、炎症反应、细胞老化与凋亡、平滑肌增殖及细胞对肿瘤坏死因子的反应等；CC主要涉及细胞质及内质网、线粒体和溶酶体等细胞器；MF主要涉及蛋白质合成以及蛋白磷酸酶结合等。KEGG通路富集分析共得到145条相关信号通路。选取P＜ 0.05，排名前20的结果进行可视化，见图8。分析结果显示，富集得到的前20条通路主要涉及与炎症有关的IL-17信号通路、TNF信号通路、Toll样受体信号通路和NOD样受体信号通路以及各种菌类感染相关的通路等。

图7 GO生物富集图Fig.7 GO bioenrichment map

图8 KEGG通路分析图Fig.8 KEGG pathway analysis diagram

2.5.4 “成分-靶点-通路”网络构建与分析

将6个活性成分，34个靶点及20条通路间的关系，运用Cytoscape 3.8.2软件构建网络关系图，见图9。根据Cytoscape 3.8.2软件分析结果，以连接度（Degree）大于30为筛选条件，发现绿原酸（degree =60）、百蕊草素Ⅱ（degree = 35）和3，4，5-三咖啡酰奎宁酸（degree = 31）的连接度相对较高，提示这3种化合物可能是蓍草发挥作用的关键活性成分，可初步作为候选质量标志物。

图9 分子对接结果热图及分子对接可视化图Fig.9 Heat map of molecular docking results and visualization of molecular docking

图9 “成分-靶点-通路”网络图Fig.9 ＂Component-target-pathway＂ network diagram

2.2.5 分子对接

分子对接结果显示（表5），所有关键活性成分与核心靶点间结合能均低于-5.0 kcal/mol，说明成分与靶点间可以自发结合且结合活性良好，表明蓍草中有机酸类及黄酮苷类成分可以作用于核心靶点发挥药理作用，为进一步研究提供依据。相关可视化结果见图9。

表5 分子对接结合能Tab. 5 Molecular docking binding energy

3 讨论

3.1 基于“五原则”的质量标志物研究

中药质量关乎中药临床疗效，是保证中药产业健康发展的基础［14］。中药质量标准的提升对于中医发展具有重要意义，为提升中药质量标准，刘昌孝院士在对现有质量评价方法和体系及存在的问题进行研究后，提出了中药质量标志物的概念［3］。张铁军等［4］进一步归纳出有效、特有、传递与溯源、可测和处方配伍的“五原则”，“五原则”从多个维度全面系统的考量中药的优劣，为中药的质量传递与溯源提供依据，对促进建立中药全程质量控制体系和提高中药产业质量控制水平提供了路径。

本研究基于中药质量标志物的理念，聚焦蓍草中有机酸和黄酮类化合物进行研究。首先采用高效液相色谱法对来自内蒙古、河南、吉林和甘肃4个产地21批次的蓍草建立指纹图谱并对化学成分进行表征。确定了13个共有峰，通过对照品比对指认出绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、百蕊草素Ⅱ和3，4，5-三咖啡酰奎宁酸 6个化学成分并测定其含量。多元统计分析结果显示，百蕊草素Ⅱ和3，4，5-三咖啡酰奎宁酸属于蓍草的差异性成分。

3.2 蓍草活性成分药理活性论证

通过网络药理学分析，发现绿原酸、百蕊草素Ⅱ和3，4，5-三咖啡酰奎宁酸为关键活性成分，其主要作用于TNF、IL-6、IL-1B和ALB等38个关键靶点，通过IL17、TNF、Toll样受体和NOD样受体等信号通路发挥抗炎、抗菌、解热镇痛的作用。

IL-17、TNF信号通路和Toll样受体信号通路是重要的抗炎信号通路。Guo等［15］发现绿原酸可以通过抑制HSV-1感染细胞中的TLR-2和TLR-9的增加来抑制炎症因子TNF和IL-6释放，从而提高小胶质细胞的存活率。炎症是机体的自我保护机制，过度的炎症反应会损伤机体。炎症反应涉及机体内的多条通路，比如HIF-1、NF-κB等多条信号通路［11，16］。绿原酸具有很强的抗炎活性，其能通过抑制人肠上皮细胞中p38级联磷酸化和核因子NF-κB信号通路的上调发挥抗炎作用［17-18］。百蕊草素Ⅱ和3，4，5-三咖啡酰奎宁酸具有良好的抗炎和抗氧化活性，百蕊草素Ⅱ可以通过抑制TLR4/NF-κB的表达来降低炎症因子的分泌，从而发挥抗炎作用，且无细胞毒性。而且在角叉菜胶诱导的小鼠爪水肿模型中，百蕊草素Ⅱ可以增强超氧化物歧化酶的活性，降低丙二醛的含量，抑制环氧合酶-2的表达，从而发挥良好的抗氧化作用［19］；3，4，5-三咖啡酰奎宁酸能够显著降低TNF-α和IL-1β炎症因子水平［20］。而异绿原酸类化合物对LPS诱导的炎症细胞也均具有抗炎作用，能够显著降低NO、TNF-α和IL-6等炎症因子的水平［21］，此外，异绿原酸A通过抑制NF-κB/NLRP3信号通路活化而降低LPS诱导的COX-2和iNOS的表达，逆转IL-6、TNF-α和PGE2的表达，减轻炎症反应［22］。PGE2被认为在炎性疼痛和神经性疼痛中具有重要作用［23］。通过对作用靶点进行GO富集分析后发现，各成分的生物功能主要涉及炎症反应、氧化反应、凋亡、细胞生物膜以及蛋白酶的结合等。研究发现，绿原酸、异绿原酸B和百蕊草素Ⅱ均具有抗菌活性。绿原酸可以增加细菌细胞内ROS的消耗，促使细胞内钙离子浓度增加，导致Caspase样蛋白被激活引起凋亡反应，同时绿原酸还能增加细菌细胞膜外膜和质膜的通透性引起细菌的屏障功能不可逆转的丧失从而产生抗菌作用［24-25］；百蕊草素Ⅱ能够降低白色念珠菌475/15菌株的细胞膜生成能力［20］；异绿原酸B能够抑制志贺芽孢杆菌的生长［26］。上述成分的药理作用主要为抗炎、抗氧化和抗菌等，与文献报道的蓍草药理作用一致。

此外，绿原酸和百蕊草素Ⅱ还具有活血和降血脂的功效，有研究发现，二者可以显著降低总胆固醇和甘油三酯水平［27-28］，其作用机制可能与下调脂质氧化基因PPAR-α、HMGR和CPT-1等的表达和抑制脂质堆积有关［29］。而且绿原酸还可以显著降低人或大鼠血液中IL-1β、CCL5和CD40配体等炎症介质，同时对血液中血小板的合成以及血小板的聚集具有抑制作用，该作用可能通过刺激抑制血小板活化PKA通路实现［30-31］。百蕊草素Ⅱ能够通过降低VEGF的过度表达从而达到扩张血管的作用［32］。而蓍草的传统功效为解毒利湿、活血止痛，这些功效分别与抗炎、抗菌、利尿通便和通畅血管等药理作用相关［33］。

4 结论

上述筛选的关键活性成分的药理作用与蓍草的传统功效关联紧密且在蓍草中含量丰富可测，同时百蕊草素Ⅱ和3，4，5-三咖啡酰奎宁酸为引起不同产地蓍草间质量差异的成分，因此推测绿原酸、百蕊草素Ⅱ和3，4，5-三咖啡酰奎宁酸可以作为蓍草的潜在质量标志物。这为蓍草质量标准的提升和全程质量控制提供了一定参考，也为后续其药效物质基础及作用机制研究奠定了基础。