几种诱抗剂对西瓜ZYMV 的防治效果评价

郝小苑，刘卓文，刘枫楠，刘莉铭，吴会杰，古勤生，康保珊，2*

（1 中国农业科学院郑州果树研究所，河南省果树瓜类生物学重点实验室，河南郑州 450009；2 中国农业科学院中原研究中心，河南新乡 453500）

病毒性病害是农作物病害中一类特殊的病害，其传播快、防治难，号称“植物癌症”，植物感染病毒病后主要症状表现为花叶、枯斑、坏死、畸形、黄化等。病毒是专性寄生物，依赖寄主体内的蛋白进行增殖、传播，消耗寄主营养，造成植物发育不良或畸形生长。一般化学药物很难抑制病毒的繁殖和运动，目前国内尚无防治病毒病的理想农药产品。

植物免疫诱抗剂又称植物疫苗，是近几年发展的一类新型生物农药，包括蛋白多肽类、寡糖类、有机酸类和无机化合物类等（Qiu et al.，2017）。诱抗剂对农作物病虫害没有直接的杀灭作用，是由外源生物或分子通过诱导或激活植物的免疫系统并调节植物的新陈代谢，改善植物的养分状况，增强抵抗病虫害的能力，从而达到防病、抗病的目的。目前已有多种植物免疫诱抗剂在生产中应用。植物病原菌产生的蛋白Harpin 在1992 年被证实可以提高作物产量，改善作物生长状况，而且可以增强对病毒病的抗性和抵抗蚜虫侵害的能力（Wei et al.，1992；Baker et al.，1993），之后研发出含该蛋白的颗粒生物制剂用于植物保护（Grisham，2000），并应用于多个国家的烟草、蔬菜以及水果种植中；病原菌细胞壁的组成成分壳寡糖也是一种有效的天然植物免疫诱抗剂，被证明可以促进植物生长和对非生物胁迫的耐受性，以及提高多种作物的抗病性（Pichyangkura & Chadchawan，2015），目前已对壳寡糖及其衍生物进行商业化规模生产。很多研究证明，免疫诱抗剂可以诱导植物产生系统获得性抗性（SAR）（Bektas & Eulgem，2014），例如苯丙噻二唑（闫涛 等，2009；Wei et al.，2011）、β-氨基丁酸（Hamiduzzaman et al.，2005）、壳寡糖（商文静，2006）、水杨酸（Li et al.，2012）、单萜（Riedlmeier et al.，2017）等。随着食品安全和环境安全越来越受到人们的关注，作为绿色生物防治剂的植物免疫诱抗剂将会成为开发和应用防治产品的新趋势。

目前市场上还没有专门针对葫芦科作物尤其西瓜防治病毒病害的诱抗剂，而且由于不同寄主间免疫抗性机制的差异，当同种诱抗剂应用于不同作物及不同病害时，防治极可能无效。小西葫芦黄花叶病毒（zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）引起的病害是西瓜生产中常见的病毒病害，危害非常严重，全球范围内均有发生，是目前危害中国葫芦科作物最主要的流行病害之一（古勤生，2002）。本研究针对西瓜ZYMV，开展了6 种不同浓度和类型的诱抗剂及其复配组合对ZYMV 的防治效果试验，以期筛选出防效较好的化学诱抗剂组合，为瓜类病毒病害的绿色防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料与病毒

试验于2021 年5—11 月在中国农业科学院郑州果树研究所进行。供试西瓜品种：红和平，购自浙江勿忘农种业股份有限公司。将西瓜种子在水中浸泡6 h，用湿纱布包裹置于28 ℃培养箱中催芽，待芽长出后播种于装有营养土的营养钵中，每钵1粒，置于培养室中（23～27 ℃），常规管理，植株长到两叶一心时，待用。试验期间西瓜幼苗的生长和处理均在培养室中进行。

ZYMV 侵染性克隆：由中国农业科学院郑州果树研究所西甜瓜病虫害防控实验室采用ZYMVCH87 分离物构建（刘莉铭 等，2021）。

供试药剂：壳寡糖购于北京瑞达恒辉科技发展有限公司，没食子酸（gallic acid，GA）购于生工生物工程（上海）股份有限公司，L-哌啶酸（Pip）购于上海贤鼎生物科技有限公司，β-氨基丁酸（BABA）购于上海麦克林生化科技股份有限公司，N-羟基哌啶酸（NHP）购于MCE 生物科技有限公司，2，1，3-苯丙噻二唑（BTH）购于西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，阿泰灵购于河北中保绿农作物科技公司。

1.2 药剂处理

将药剂按照试验浓度进行配制，其中药剂对照（CK+ ）溶液为阿泰灵粉末稀释40 倍液。BABA溶液：先加入少量无水乙醇，待药剂完全溶解后，加入蒸馏水配制成50 mmol · L-1的母液，4 ℃保存；喷施前用蒸馏水稀释成浓度梯度分别为5 mmol · L-1和1 mmol · L-1的工作液。BTH 溶液：先加入少量无水乙醇，待药剂完全溶解后，加入蒸馏水配制成5 mmol · L-1母液，4 ℃保存；喷施前用蒸馏水稀释成浓度梯度分别为0.5 mmol · L-1和0.1 mmol · L-1的工作液。壳寡糖溶液：蒸馏水溶解，并在水浴锅中加热助溶，配制成5 g · L-1的母液，室温保存；喷施前用蒸馏水稀释成浓度梯度分别为2.5 g · L-1和1 g · L-1的工作液。没食子酸溶液：蒸馏水溶解，配制成1 g · L-1的母液，室温保存；喷施前用蒸馏水稀释成浓度梯度分别为0.5 g · L-1和0.1 g · L-1的工作液。Pip 溶液：蒸馏水溶解，配制成100 mmol ·L-1的母液，4 ℃保存；喷施前用蒸馏水稀释成浓度分别为2 mmol · L-1和1 mmol · L-1的工作液。NHP溶液：蒸馏水溶解，配制成10 mmol · L-1的母液，-20℃保存；喷施前用蒸馏水稀释成浓度梯度分别为0.5 mmol · L-1和0.1 mmol · L-1的工作液。

西瓜幼苗两叶一心时喷施药剂，间隔24 h 喷施1 次，共喷施3 次，在第3 次喷施后12 h 人工接种病毒。设置无菌水处理为对照（Mock），每个处理10 株西瓜幼苗，重复3 次。接种病毒后第8天开始观察症状，记录植株的显症率以及发病情况。

1.3 接种病毒

为保证接种效率，采用农杆菌介导侵染性克隆接种：将含有pXT1-ZYMV 质粒的农杆菌GV3101接种于LB 液体培养基（含有50 μg · mL-1卡那霉素、50 μg · mL-1利福平）中，28 ℃，220 r · min-1培养24 h 以上，菌体经离心收集后，用相同体积的诱导缓冲液（含有10 mmol · L-1MgCl2、10 mmol ·L-1MES 和100 μmol · L-1乙酰丁香酮）重悬，室温静置诱导2～12 h，用1 mL 注射器将诱导后的农杆菌注射接种于西瓜幼苗的子叶背面，待子叶叶片全部接满即可（每株约接种0.4 mL）。

1.4 病情调查与统计

接种后第8 天开始统计各处理植株的显症率，待对照植株的显症率达到100%时，调查各处理植株的病情级别，根据植株生长状态，调查心叶或心叶下方第1 片真叶。记录植株显症率，并计算病情指数及相对防治效果。接种后15 d 调查显症率。

根据症状表现并参考古勤生（2001）的方法，将病情划分为0～5 级：0 级，无症状；1 级，只表现褪绿斑或明脉；2 级，轻度花叶，无蕨叶；3 级，严重花叶，无蕨叶；4 级，严重花叶，轻微蕨叶；5 级，严重花叶和蕨叶，叶片畸形严重（图1）。

图1 西瓜ZYMV 病情分级标准

显症率 = 显症株数/调查总株数 × 100%

病情指数 = ∑（某病级株数 × 病情级数）/（调查总株数 × 最高级数） × 100

相对防治效果 = （对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数 × 100%

1.5 数据处理

试验数据取3 次重复的平均值，用Microsoft Excel 进行统计处理。在P＜ 0.05 水平上，用SPSS 软件以单因素ANOVA 分析邓肯氏新复极差法对病情指数进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 确定诱抗剂最适浓度

供试6 种药剂分别采用2 个浓度喷施西瓜幼苗（表1），在对照（Mock）的显症率达到100.00%时（第11 天），统计处理组的发病情况。结果显示，除0.5 mmol · L-1BTH 和1 mmol · L-1Pip 外，其余药剂处理植株显症率均低于100%，且与对照植株都存在显著差异；其中0.5 mmol · L-1NHP和2 mmol · L-1Pip 处理后植株显症率和病情指数均明显低于对照，且0.5 mmol · L-1NHP 的相对防效最高，达到73.33%。根据植株的显症率和相对防效，筛选出各药剂的最大适宜浓度，且按防效高低依次为：NHP（0.5 mmol · L-1）、Pip（2 mmol · L-1）、壳寡糖（1 g · L-1）、没食子酸（0.5 g · L-1）、BABA（1 mmol · L-1）、BTH（0.1 mmol · L-1）。

2.2 复配药剂对病毒的防治效果

2.2.1 2 种药剂复配对病毒的防治效果 根据单一组分药剂对病毒的防治效果，将筛选出的药剂浓度两两混合，共设置11 个药剂组合进行防效试验，结果显示（表2）：不同诱抗剂组合都对ZYMV 有一定的抑制作用，各处理病情发展速度均较对照慢。在对照组显症率达到100.00%时，有5 个药剂组合处理的植株显症率低于50%，组合2-Ⅶ的显症率最低，仅为10.00%，其次为2-Ⅰ、2-Ⅴ、2-Ⅸ和2-Ⅺ，显症率分别为40.00%、30.00%、33.33%和25.00%；各药剂组合的病情指数均明显低于对照，其中2-Ⅶ、2-Ⅴ病情指数明显低于其他处理，两处理相对防效分别为89.99%、75.72%，其次为2-Ⅸ，相对防效为73.34%。在病毒接种15 d 后，组合2-Ⅸ的显症率最低，仍有20.00%的植株没有明显症状（图2）。结合显症率增加速度和相对防效，2-Ⅶ的防治效果优于2-Ⅸ。虽然组合2-Ⅶ处理过的植株显症率增长明显较对照组缓慢，但是该组合处理后的植株相对于对照植株生长明显矮小，并且生长速度相对缓慢（图3）。

表2 2 种药剂复配组合对西瓜ZYMV 的防治效果

图3 喷施诱抗剂组合2-Ⅶ后植株的生长状态

2.2.2 3 种药剂复配对病毒的防治效果 根据单一药剂和2 种药剂复配的试验结果，进一步设置了3 种药剂的复配组合进行防效试验（表3）。结果显示（图4），接种后11 d 时，无菌水对照组植株显症率达到100.00%，而3-Ⅰ、3-Ⅱ和3-Ⅲ组合的植株显症率低于50%，分别为27.27%、33.33%和47.06%；供试7 个复配组合的相对防效均在40%以上，3-Ⅰ、3-Ⅱ、3-Ⅳ、3-Ⅵ组合病情指数明显低于其他组合，且3-Ⅰ、3-Ⅱ组合的相对防效分别为79.49%、68.27%，显著高于其他组合。其中3-Ⅱ组合显症率增长最慢，并且比对照病症轻、长势更好（图5），到接种后17 d 时仍有25.00%的植株没有明显症状。综合显症率和相对防效，组合3-Ⅱ防治效果最好，显症率低且效果持久。

表3 3 种药剂复配组合对西瓜ZYMV 的防治效果

图4 3 种诱抗剂复配组合后植株的显症率

图5 喷施处理3-Ⅱ和无菌水后10 d 植株及叶片表型

试验中发现喷施3-Ⅱ、3-Ⅲ和3-Ⅵ组合后，12～24 h 内植株会出现轻微过敏性坏死斑（图6），其中3-Ⅱ组合出现过敏性坏死反应的植株比例最高，为63.7%，3-Ⅲ为35.2%，3-Ⅵ为11.1%，表明复配后的药剂可能会诱导植株产生过敏性坏死反应从而增强植株的抗性。

图6 喷施处理3-Ⅱ后24 h 植株产生过敏性坏死反应

3 结论与讨论

本试验中，喷施药剂组合2-Ⅶ后植株长势相比对照明显变缓。Kim 等（2009）研究指出，免疫系统过度激活会对植物产生不利影响，因此推测喷施2-Ⅶ组合的植株生长迟缓可能与过度免疫反应有关。因此，虽然诱抗剂的使用明显降低了植株的显症率，但是上述诱抗剂的施用浓度、喷施间隔时间仍需调整优化，以平衡植株抗病与生长之间的关系。

Pip 及其衍生物NHP 是植物响应病原体产生系统获得性抗性（SAR）的重要信号化合物。Návarová 等（2012）在研究拟南芥系统获得性抗性（SAR）时发现，丁香假单胞菌诱导的SAR 植株中能够检测到高浓度的Pip，而未接种叶片中则几乎检测不到。此外，Pip 还能够诱导黄瓜增强对枯萎病菌的防御反应，并加速上调SAR 相关基因的转录（Pazarlar et al.，2021）。除Pip 外，NHP 也是SAR 的关键调节剂，可以从病原体侵染部位移动至整个植株，并显著累积，激活SAR 抗病系统（Schnake et al.，2020）。NHP 能够诱导植物免疫基因的表达以增强防御能力，放大防御反应，并且可以与防御激素水杨酸协同作用，促进细胞过敏性坏死反应，为植物在未来病原体攻击的情况下有效地激活免疫系统做好准备（Hartmann & Zeier，2018）。本研究中，Pip 及NHP 对西瓜ZYMV 具有较好的预防效果，可能与二者启动植株防御系统作用相关。

没食子酸也在西瓜ZYMV 预防中展现出一定的作用。没食子酸是一种多酚类化合物，已被证明具有抗菌（Kang et al.，2018）、抗病毒（Mayela et al.，2016；You et al.，2018）、 抗 肿 瘤（Ho et al.，2010）、 抗 炎（Bai et al.，2021；Toyama et al.，2022）、抗氧化（Owumi et al.，2020；Nouri et al.，2021）等多种生物活性。前期研究发现，没食子酸能够诱导烟草植株的病程相关蛋白PRs 的表达（李红霞，2010），并且没食子酸的衍生物被证明能诱导植株产生抗病信号（李黔柱，2009），增强植物的系统抗病性。本研究结果也表明没食子酸在西瓜ZYMV 的防治中具有潜在作用。

在本研究3 种药剂复配的组合中，3-Ⅱ、3-Ⅲ和3-Ⅵ均不同程度地表现出HR 反应，且这3 个组合均包含没食子酸和Pip，进一步表明这两种诱抗剂可诱导西瓜植株产生抗病反应。

除了Pip、NHP 和没食子酸之外，BTH、壳寡糖和BABA 等其他诱抗剂在烟草花叶病毒（TMV）防治中也表现出良好的效果（赵淑请和郭剑波，2003；商文静，2006；周程爱 等，2007）。然而，在本研究中BTH、壳寡糖和ABA 对于西瓜ZYMV的防效作用并不明显，可能是因为不同植物激活免疫系统的机制存在差异，并且处理时期、处理方法或处理浓度等因素也可能导致效果差异。因此，需要进一步的试验来完善和优化这些诱抗剂的使用，并深入研究其诱导植物抗病性的分子机理。

综上所述，在瓜类病毒病害的绿色防控中，Pip、NHP 和没食子酸等诱抗剂具有潜在的应用价值。后续研究可以结合植物内部抗性基因和生理生化指标的变化，优化药剂复配比例、施用方法和施用部位，以实现最佳的诱导抗病效果，并为瓜类病毒病害的有效防治提供方法和策略。