miR-143-3p 和miR-509-5p 在儿童肺炎支原体肺炎疾病程度及预后评估中的应用价值

杨肖翠 刘清华 程效增 黄 薇 李 静

肺炎是呼吸科常见疾病，症状主要为发热、咳嗽、胸痛等，病情进展较快［1］。肺炎病原菌包含病毒、细菌、支原体等类型，其中肺炎支原体肺炎在5～15 岁的儿童中多发，属于原发性非典型肺炎，为小儿呼吸道感染的常见病，占30%以上，支原体属于细胞内的微生物，一旦感染后想要清除非常困难，肺炎支原体肺炎除具有本身的肺炎特征外，极易导致并发症，再加上小儿自身免疫能力较差，对儿童的身体健康造成了严重影响［2-3］。miRNA 在肺炎支原体肺炎中发挥的作用也已被证实［4］。微小核糖核酸-143-3p（microRNA-143-3p，miR-143-3p）在增殖、凋亡等细胞活动中发挥重要作用［5］，研究显示，miR-143-3p 对肺炎支原体肺炎小鼠细胞凋亡具有抑制作用，且可降低小鼠肺部炎症因子［6］。猜测miR-143-3p 可能与肺炎支原体肺炎的发生发展有关。微小核糖核酸-509-5p（microRNA-509-5p，miR-509-5p）在绵羊肺炎支原体肺炎的耐药性中发挥关键作用，其可调控炎症反应［7］，其是否在肺炎支原体肺炎患儿中发挥作用仍未见研究。因此，本研究旨在分析血清miR-143-3p、miR-509-5p 与肺炎支原体肺炎患儿疾病严重程度的关系，并分析血清miR-143-3p、miR-509-5p 对患儿预后的鉴别能力，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020 年5 月至2022 年4 月邯郸市妇幼保健院收治的肺炎支原体肺炎患儿135 例作为肺炎支原体肺炎组，其中男患儿71 例，女患儿64例；年龄2～14 岁，平均（7.58±2.25）岁。根据疾病严重程度［9］，分为轻症组84 例和重症组51 例。另选取同期体检健康儿童130 例作为对照组，其中男患儿68例，女患儿62 例；年龄2～14 岁，平均（7.62±2.24）岁。肺炎支原体肺炎组与对照组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。纳入标准：①符合第7 版《实用儿科学》中肺炎支原体肺炎［8］诊断标准者；②配合肺功能测定者；③家属知情同意。排除标准：①合并先天性疾病者；②合并免疫系统疾病者；③合并恶性肿瘤者；④入组前使用糖皮质激素与免疫调节剂者。排除标准：既往免疫性疾病儿童及入组前2 周内具有呼吸道感染、过敏性疾病儿童。本研究经医院伦理委员会批准（审批号：2020416-02）。

1.2 方法

1.2.1 样本收集 肺炎支原体肺炎患儿入院次日、对照组体检时分别抽取5 mL 空腹肘静脉血，血液经离心后，留取上清，-20℃冰箱保存待测。

1.2.2 实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qRT-PCR）法测定血清miR-143-3p 与miR-509-5p 水平 RNA 提取试剂盒提取血清RNA，将一定量RNA 反转录为cDNA。采用CFX384 Touch™定量PCR仪（美国Bio-Rad 公司）对miR-143-3p 与miR-509-5p进行扩增。反应条件：95℃，90 s；95℃，30 s；63℃，30 s；72℃，15 s；40 个循环。miR-143-3p、miR-509-5p 与内参U6 的引物序列见表1。采用2-ΔΔCT法进行数据分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 肺功能测定 检查当天清理鼻腔分泌物，精确测量患儿体质量，选择合适面罩罩于面部，保证无漏气，调节肺功能仪参数，观察患儿呼吸频率（respiratory rate，RR）、潮气量（tidal volume，VT）、呼气时间（expiratory time，Te）、达峰时间（peak time，TPTEF）、达峰容积（peak volume，VPTEF）、计算TPTEF/Te、VPTEF/VT。

1.2.4 预后情况 根据病情好转情况，将肺炎支原体肺炎患儿分为预后良好组（81 例）与预后不良组（54例）。其中，症状、体征、实验室指标提示病情加重，即体温未明显下降，咳嗽和肺部症状加重，X 线胸片提示肺部病灶为吸收或加重或需患儿转入上级医院治疗者，为预后不良；患儿体温正常，咳嗽和哮喘症状明显缓解，X 线胸片显示肺部病灶吸收或消失，如满足上述一项或多项指标，则为预后良好。

1.3 观察指标 观察两组对象血清miR-143-3p、miR-509-5p 水平。观察不同严重程度肺炎支原体肺炎患儿肺功能指标、血清miR-143-3p、miR-509-5p 水平。分析患儿血清miR-143-3p 和miR-509-5p 水平与肺功能指标相关性。观察不同预后情况患儿血清miR-143-3p、miR-509-5p 水平。分析血清miR-143-3p 和miR-509-5p 水平对重症肺炎支原体肺炎以及预后不良的预测价值。

1.4 统计学方法 应用SPSS 25.0 进行统计分析，符合正态分布的计量资料以表示，两组间均数比较采用独立样本t检验；采用Pearson 法分析血清miR-143-3p 和miR-509-5p 水平与肺功能指标相关性；采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析血清miR-143-3p 和miR-509-5p 对重症肺炎支原体肺炎以及预后不良的预测价值；以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组与肺炎支原体肺炎组血清miR-143-3p 和miR-509-5p 水平比较 与对照组相比，肺炎支原体肺炎组miR-143-3p、miR-509-5p 水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 对照组与肺炎支原体肺炎组血清miR-143-3p、miR-509-5p水平比较（）

表2 对照组与肺炎支原体肺炎组血清miR-143-3p、miR-509-5p水平比较（）

注：miR-143-3p为微小核糖核酸-143-3p，miR-509-5p为微小核糖核酸-509-5p。

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2.2 不同严重程度肺炎支原体肺炎患儿肺功能比较与轻症组相比，重症组肺炎支原体肺炎患儿RR 升高，VT、TPTEF/Te、VPTEF/VT 降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 不同严重程度肺炎支原体肺炎患儿肺功能比较（）

表3 不同严重程度肺炎支原体肺炎患儿肺功能比较（）

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2.3 不同严重程度肺炎支原体肺炎患儿血清miR-143-3p 和miR-509-5p 水平比较 与轻症组相比，重症组肺炎支原体肺炎患儿血清miR-143-3p、miR-509-5p 水平降低（P＜0.05）。见表4。

表4 不同严重程度肺炎支原体肺炎患儿血清miR-143-3p、miR-509-5p水平比较（）

表4 不同严重程度肺炎支原体肺炎患儿血清miR-143-3p、miR-509-5p水平比较（）

注：miR-143-3p为微小核糖核酸-143-3p，miR-509-5p为微小核糖核酸-509-5p。

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2.4 肺炎支原体肺炎患儿血清miR-143-3p 和miR-509-5p水平与肺功能相关性分析 肺炎支原体肺炎患儿血清miR-143-3p、miR-509-5p 与RR 无相关性（P＞0.05），与VT、TPTEF/Te、VPTEF/VT 均呈正相关（P＜0.05）。见表5。

表5 肺炎支原体肺炎患儿血清miR-143-3p、miR-509-5p与肺功能相关性分析

2.5 不同预后情况患儿血清miR-143-3p 和miR-509-5p 水平比较 与预后良好组相比，预后不良组肺炎支原体肺炎患儿血清miR-143-3p、miR-509-5p 水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表6。

表6 不同预后情况患儿血清miR-143-3p、miR-509-5p水平比较（）

表6 不同预后情况患儿血清miR-143-3p、miR-509-5p水平比较（）

注：miR-143-3p为微小核糖核酸-143-3p，miR-509-5p为微小核糖核酸-509-5p。

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2.6 血清miR-143-3p 和miR-509-5p 水平对重症患儿以及预后的预测价值 以患儿严重程度（轻症组=0，重症组=1）为状态变量，血清miR-143-3p 和miR-509-5p 水平为检验变量，绘制ROC 曲线。结果显示，血清miR-143-3p 预测重症患儿的曲线下面积（area under the curve，AUC）为0.820，灵敏度为82.4%，特异度为83.3%，截断值为0.235；血清miR-509-5p 预测重症患儿的AUC 为0.849，灵敏度为72.5 %，特异度为92.9 %，截断值为0.355。以患儿预后情况（预后良好=0，预后不良=1）为状态变量，血清miR-143-3p 和miR-509-5p 水平为检验变量，绘制ROC 曲线。结果显示，血清miR-143-3p 预测预后不良的AUC 为0.735，灵敏度为79.6%，特异度为63.0%，截断值为0.245；血清miR-509-5p 预测预后不良的AUC 为0.859，灵敏度为81.5%，特异度为87.3%，截断值为0.345。见图1、2 和表7、8。

图1 血清miR-143-3p和miR-509-5p预测重症肺炎支原体肺炎的ROC曲线

图2 血清miR-143-3p和miR-509-5p预测预后不良的ROC曲线

表7 miR-143-3p、miR-509-5p对重症肺炎支原体肺炎的预测价值

表8 miR-143-3p、miR-509-5p对肺炎支原体肺炎患儿预后不良的预测价值

3 讨论

支原体诱发的肺炎是儿科常见呼吸道疾病，以发热、咳嗽为主要症状，易被认为是普通感冒，未规范治疗易损伤患者心、肺等脏器，甚至威胁生命。因此及时筛查重症患者及预后不良患者，给予相应防治措施对于挽救患者生命健康至关重要。

免疫紊乱、炎症反应是参与肺炎支原体肺炎进展的关键，二者相互促进，构成反馈调节，加重肺炎支原体肺炎的进展［10-11］。miRNA 在免疫调节与炎症反应中发挥重要作用，其在肺炎支原体肺炎患者体内异常表达［12-14］。本研究结果显示，肺炎支原体肺炎患儿血清miR-143-3p 水平低于体检健康儿童，与刘沛等［15］研究结果相反，可能原因为miR-143-3p 表达存在组织特异度，肺炎支原体肺炎重症组与轻症组间存在差异，提示miR-143-3p 可能参与肺炎支原体肺炎的发展。支原体感染可引发气道炎症反应，损伤肺功能，肺部检查是判断疾病严重程度的手段。本研究发现，miR-143-3p与肺功能相关指标VT、TPTEF/Te、VPTEF/VT 均呈正相关，进一步提示miR-143-3p 与疾病严重程度相关，经ROC 曲线分析，血清miR-143-3p 水平低于0.235 时，重症发生的可能性更高。此外，miR-143-3p 水平对于区分预后情况也有帮助，预后不良组miR-143-3p 水平低于预后良好组，当血清miR-143-3p 水平低于0.245时，预后不良的可能性高，截断值在数值上与重症患儿接近，但略有升高，意味着重症患儿与预后不良患儿具有较高的交叉性，但仍有少部分轻症患儿预后不良。提示miR-143-3p 在儿童肺炎支原体肺炎的病情评估以及预后中具有重要价值。

miR-509-5p 在癌症中研究较多［16-17］。人囊性纤维化与非囊性纤维化气道上皮细胞中miR-509-3p 水平不同，人囊性纤维化气道上皮中miR-509-3p 水平升高，miR-509-3p 可调节人囊性纤维化上皮细胞的炎性介质［18］。另外，miR-509-5p 在绵羊肺炎支原体肺炎的耐药性中发挥关键作用，miR-509-5p 可调控绵羊炎症反应［7］。本研究中，肺炎支原体肺炎患儿血清miR-509-5p 水平低于对照组，且重症组血清miR-509-5p水平低于轻症组，预后不良组血清miR-509-5p 水平低于预后良好组，miR-509-5p 与VT、TPTEF/Te、VPTEF/VT 呈正相关，提示miR-509-5p 水平与肺炎支原体肺炎严重程度以及预后相关，经ROC 曲线分析，当肺炎支原体肺炎患儿血清miR-509-5p 水平低于0.355 时，发生重症的可能性较高，此时AUC 为0.735，当血清miR-509-5p 水平低于0.345，预后不良的可能性高，AUC 为0.859，灵敏度和特异度均较高，提示血清miR-509-5p 水平对判断肺炎支原体肺炎的严重程度以及预后具有重要价值。已有许多研究报道CRP 和D二聚体水平与肺炎支原体肺炎病情发展有关［19-20］，但本研究未进行二者水平检测，未能研究二者与miR-143-3p 和miR-509-5p 之间的关系，此为本研究不足之处，后续本研究将进一步扩大样本量深入研究miR-143-3p 和miR-509-5p 与CRP 和D 二聚体的关系以及与疾病进展关系，为二者作为临床病情评估标志物提供理论依据。

综上所述，肺炎支原体肺炎患儿血清miR-143-3p、miR-509-5p 水平降低，二者均对肺炎支原体肺炎的严重程度与预后具有判别价值，有望作为临床病情评估以及预后判断的指标。但本研究对miR-143-3p、miR-509-5p 影响肺炎支原体肺炎进展的机制仍不明晰，尚需进行细胞实验探讨。