天智颗粒对帕金森病小鼠模型黑质和脊髓多巴胺能神经元的影响*

陈丹丹,李 丽,于 宁,刘晓庆

(山东中医药高等专科学校:1.医学系;2.科研处,山东 烟台 264100)

帕金森病(PD)是由遗传和环境等因素共同作用导致的一类神经退行性疾病,患者出现运动症状和一系列非运动症状[1],导致生活质量下降及严重的家庭经济负担。我国PD发病率呈上升趋势,成为目前增长速度最快的神经系统疾病[2]。PD病变部位主要为中脑黑质、边缘系统、大脑皮质等,但有研究表明,PD病变部位除上述部位外,尚累及脊髓神经元[3]。

天智颗粒由《中医内科杂病证治新义》中的验方“天麻钩藤饮”化裁而成,具有活血化瘀、平肝熄风、补益肝肾等功效。已有临床和实验研究证实,天智颗粒对脑血管疾病具有一定的疗效,可有效改善患者行为和日常生活能力[3-4]。但针对天智颗粒保护PD患者多巴胺(DA)能神经元的效用和机制进行的研究很少见,对中脑黑质-纹状体通路以外的中枢神经部位DA能神经元损伤进行的研究则更少见。故本研究通过1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)腹腔注射的方法构建PD小鼠模型,研究了天智颗粒对其中脑黑质和脊髓部位DA能神经元的影响,现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 2022年9月选取C57BL/6J小鼠50只,无特定病原体级,体重18～22 g,8～12周龄,雌雄不拘。购自山东济南朋悦实验动物繁育有限公司,合格证号[SCXK(鲁)20190003]。本研究已通过山东中医药高等专科学校实验动物伦理审查委员会审批。实验于20～25 ℃清洁级实验室进行,单笼饲养,自然光照,自由饮水进食,适应性喂养1周。

1.1.2主要试剂及仪器 天智颗粒(Lot:091201,河南宛西制药公司)、MPTP(Lot:143208,百灵威科技有限公司)、兔抗小鼠酪氨酸羟化酶(TH,Lot:bs-0016R,北京博奥森生物技术有限公司)、链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物免疫组化染色试剂盒(Lot:SA1052,武汉博士德生物工程有限公司)、3,3′-二氨基联苯胺四盐酸盐显色试剂盒(Lot:ZLI-9018,北京中杉金桥生物工程公司)、苏木素染色剂(Lot:G1080,北京索莱宝科技有限公司)、奥林巴斯DP-72显微镜、自制小鼠泳箱等。

1.2方法

1.2.1PD小鼠模型构建 采用随机数字表法选取10只小鼠作为正常对照组,剩余40只小鼠腹腔注射MPTP 25 mg/(kg·d),连续5 d[5]。正常对照组注射等体积的生理盐水。

1.2.2动物分组及给药 采用随机数字表法将造模成功后的40只小鼠分为模型组和天智颗粒5、2、1 g/kg(以生药量计,成人用量2倍)组,每组10只,模型组和正常对照组给予等量生理盐水灌胃,每天2 次,灌胃2周。每次灌胃后2 h进行行为学观察。

1.2.3悬挂实验 参照KURIBARA 等[6]的方法取一根长约40 cm的电线,将小鼠的后爪悬挂于电线上,2只后爪均能抓住电线计3.0分,一只后爪抓住电线计2.0分,2只后爪均抓不住电线计1.0分,无法抓住直接跌落计0分。每只小鼠检测3次,每次间隔5 min,取平均分值。

1.2.4游泳实验 将小鼠置于20 cm×30 cm×20 cm的自制泳箱内,水温22～25 ℃,2 min内连续不断游泳计3.0分,大部分时间游泳计2.5分,漂浮时间占总时长50%计2.0分,偶尔游泳计1.5分,偶尔后肢游动计1.0分。每只小鼠测3次,每次间隔5 min,取平均分值。

1.2.5取材和指标检测 灌胃2周后将小鼠麻醉,用多聚甲醛(40 g/L) 灌注固定,取中脑和脊髓标本后置于多聚甲醛(40 g/L)浸泡过夜,石蜡包埋。切片常规脱蜡入水,用3%过氧化氢-甲醇溶液孵育30 min消除内源性过氧化物酶活性,正常羊血清室温封闭30 min,弃多余血清,滴加TH(1∶200),4 ℃过夜,滴加生物素化二抗37 ℃、30 min,3,3′-二氨基联苯胺四盐酸盐避光显色,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,磷酸盐缓冲液替代一抗作为阴性对照,各步骤之间以0.01 mol/L磷酸盐缓冲液冲洗。

1.2.6图像分析 每组每只小鼠取5张黑质和脊髓部位组织切片,随机选取3个高倍视野进行黑质部阳性细胞计数,使用图像分析软件Image-Pro plus分析TH 免疫阳性神经元的平均光密度值。

2 结 果

2.1PD小鼠的行为学观察 腹腔注射MPTP后小鼠均出现不同程度行动迟缓,尾巴僵直,竖尾,竖毛等表现,持续约30 min左右,连续给药5 d后出现反应迟钝、体重减轻、毛色杂乱、后肢僵硬等表现。

2.2天智颗粒对PD小鼠悬挂评分和游泳时长的影响 与正常对照组比较,模型组、天智颗粒1 g/kg组小鼠悬挂、游泳评分均明显降低,天智颗粒2、5 g/kg组小鼠悬挂、游泳评分均明显高于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠悬挂、游泳评分比较分)

2.3各组小鼠中脑黑质部DA能阳性神经元形态及数量比较 正常对照组小鼠中脑黑质部位含有大量DA能神经元,细胞核大而圆,呈条带状排列整齐,纤维走行清晰。与正常对照组比较,模型组小鼠中脑黑质部DA能神经元数量明显减少,个头变小,突起变少甚至消失,纤维杂乱,神经元内TH平均光密度值明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,天智颗粒5、2 g/kg组小鼠灌胃2周后中脑黑质部DA能神经元形态较好且有突起伸出,突起较多,视野内纤维较粗,走行较规整且成明显连续性,神经元内TH平均光密度值上升,差异均有统计学意义(P<0.05);天智颗粒5、2 g/kg组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、表2。

注:A为观察部位(标尺=200 μm);B为正常对照组(标尺=20 μm);C为模型组(标尺=20 μm);D为天智颗粒1 g/kg组(标尺=20 μm);E为天智颗粒2 g/kg组(标尺=20 μm);F为天智颗粒5 g/kg 组(标尺=20 μm)。图1 各组小鼠中脑黑质部DA能阳性神经元形态比较

表2 各组小鼠中脑黑质部DA能神经元数量比较

2.4各组小鼠脊髓DA能神经元形态及数量比较 正常对照组小鼠脊髓DA能神经元胞体明显、细胞核清楚,神经元突起多且长。与正常对照组比较,模型组小鼠脊髓DA能神经元细胞着色浅,细胞核未见明显固缩,神经元突起减少,部分神经元只保留轴丘,多数突起消失,神经元内TH的平均光密度值明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,天智颗粒5、2 g/kg组小鼠灌胃2周后脊髓DA能神经元呈多边形,个头较大,有多个突起伸出,突起较长,走行规整且成明显连续性,灌胃前后神经元数量变化无明显差异,但灌胃后神经元内TH平均光密度值明显上升,差异有统计学意义(P<0.05);天智颗粒5、2 g/kg组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见图2、表3。

注:A为观察部位(标尺=100 μm);B为正常对照组(标尺=20 μm);C为模型组(标尺=20 μm);D为天智颗粒1 g/kg 组(标尺=20 μm);E为天智颗粒2 g/kg组(标尺=20 μm);F为天智颗粒5 g/kg 组(标尺=20 μm)。图2 各组小鼠脊髓腰骶部灰质前角(板层Ⅸ)DA能神经元形态比较

表3 各组小鼠脊髓腰骶部DA能神经元数量比较

3 讨 论

PD是一种常见于老年人的以黑质部位DA能神经元丧失为主的神经退行性疾病,发病率仅次于阿尔茨海默病[7]。2019年中国PD患者约284万人,成为世界上PD患者最多的国家。PD也成为危害老年人身体健康的三大杀手之一[8]。

PD的病变特征包括震颤、僵硬、姿势不稳定、运动迟缓,以及细胞水平上DA神经元的特异性死亡和路易体包涵体的出现。目前的医疗手段主要以改善临床症状为主,尚不能有效根治疾病[9]。PD患者除表现出一系列运动系统症状外,在发病早期还出现一系列非运动症状,如记忆异常、疼痛、便秘、排尿困难等。意味着PD患者的边缘系统、自主神经系统和脊髓等部位同时受到影响[10]。过去认为,在哺乳动物的中枢神经系统中DA能神经元只存在于脑中的一些局部区域,如间脑的A11核团,脊髓中的DA也主要来自该核团,并在整个脊髓形成广泛投射的纤维投射[11]。但多份尸检报告指出,散发性PD患者存在黑质-纹状体通路以外的神经病变,包括脊髓[12],且多个独立实验小组的研究结果支持PD患者和MPTP小鼠脊髓中出现DA能神经元的死亡[13-15]。WAKABAYASHI等[16]指出,PD不仅是一种由黑质-纹状体神经元特异性丢失引起的运动障碍,更是一种涉及整个神经系统的复杂疾病。乔原[17]在大鼠脊髓的腰骶部发现TH阳性细胞的存在,并进一步证实这些TH阳性细胞就是DA能神经元,同时,观察到了脊髓损伤后DA能神经元的可塑性变化,并证实大鼠脊髓中的DA能神经元主要分布于副交感节前神经元富集的脊髓灰质侧角及脊髓后角浅层区域,意味着其与自主神经功能及感觉传入之间的联系。因此,脊髓病变可能是导致PD患者运动前和运动阶段出现疼痛、便秘、平衡不良和性功能障碍等临床症状的原因所在[18]。

天智颗粒来源于《中医内科杂病证治新义》的经典验方天麻钩藤饮[19],主要由天麻、钩藤、石决明、杜仲、桑寄生等多种药物组成,具有活血化瘀、补益肝肾、益智安神等功效。临床常用于治疗血管性痴呆、中风肢体功能障碍、PD等神经系统疾病[3-4]。现代药理研究表明,天智颗粒可通过提高胆碱能神经功能和抗氧化酶活性,抑制脑内兴奋性氨基酸的神经毒性,改善血管性痴呆的症状[20]。君药中天麻中的主要成分天麻素可抑制DA代谢率,使DA含量升高,并对DA能神经元的形态及功能具有保护作用,还可通过提高DA能神经元细胞质内TH的活性,促进DA的合成[21-22]。

MPTP啮齿动物模型可较好地模拟PD的病理特点[23]。因此,使用MPTP诱导的C57BL/6J小鼠已成为经典的PD动物模型之一[24]。本研究采用MPTP 25 mg/(kg·d)、连续5 d腹腔注射的方法构建亚急性PD小鼠模型。药物注射后小鼠出现了肌肉震颤、竖尾、尾巴僵直、竖毛、动作迟缓等经典的PD行为学表现,符合实验需要的PD小鼠模型特征,结果显示,MPTP引起模型组小鼠中脑黑质和脊髓灰质前角DA能神经元的损伤,主要表现为神经元胞体的缩小和胞内TH的减少,DA能神经元的突起减少甚至消失。给予天智颗粒2、5 g/kg干预2周后PD小鼠黑质和脊髓灰质前角DA能神经元突起增多、变长,神经元内TH含量增加,且PD小鼠后肢悬挂时间延长,游泳能力增强。意味着在同样的情况下天智颗粒2 g/kg是促进脊髓灰质前角DA能神经元的存活、进而改善PD小鼠的行为学的最优选择。天智颗粒的保护作用与运动[25]促进脊髓TH的含量结果相似。由此推测,天智颗粒治疗PD的有效机制可能与药物促进黑质和脊髓DA能神经元及其突起的存活,提高黑质和脊髓灰质前角DA能神经元中TH的含量有关;天智颗粒可通过提高中枢神经系统内源性DA分泌,有效改善PD小鼠肌肉的运动协调能力受损的情况。但本研究结果显示,在脊髓灰质前角DA能神经元数量变化方面,治疗前后并无明显变化。

综上所述,MPTP诱导的亚急性PD小鼠模型中,中脑黑质和脊髓灰质前角部位DA能神经元及其突起均受到损伤,天智颗粒2 g/kg即可改善PD小鼠的异常行为表现,其机制可能与促进PD小鼠中脑黑质和脊髓中DA能神经元的存活、提高DA能神经元TH含量有关,为临床应用天智颗粒治疗PD提供了部分用药指导。本研究尚未涉及天智颗粒起效的分子学机制,以及相关蛋白、基因等的表达变化,故尚需进一步的探索和深入研究。