碳酸钙D3颗粒（Ⅱ）中维生素D3含量测定的不确定度评定
2024-02-25朱晓月吴兆伟安京烨
朱晓月，吴兆伟，安京烨，刘 齐，郑 洁，孙 毅，王 琳
（北京市药品检验研究院<北京市疫苗检验中心>·国家药品监督管理局仿制药研究与评价重点实验室·中药成分分析与生物评价北京市重点实验室，北京 102206）
碳酸钙D3颗粒（Ⅱ）主要用于补钙和防治骨质疏松症，较其他补钙制剂经济学评价好［1］，临床应用广泛。但前期研究发现，按现行标准《国家药品标准》WS1-XG-033-2021中的标准方法测定样品中维生素D3含量时，2 份样品结果偏低且不平行。在药品检验领域，通过对方法不确定度的研究，可找出影响结果偏差的主要因素［2-8］。为此，依据《测量不确定度评定与表示》JJF 1059.1-2012［9］中的相关规定，通过建立数学模型，分析不确定度来源，计算各分量合成不确定度及方法扩展不确定度，对该标准方法进行不确定度评定。
1 仪器与试药
1.1 仪器
LC-20AT 型高效液相色谱仪（日本Shimadzu 公司），配有SPD-M20A 型二极管阵列检测器（PDA）；XA205DU 型电子天平（梅特勒-托利多国际贸易<上海>有限公司，精度为0.01 mg）；SB25-12DT 型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司，功率为500 W）；HZQ-F 160 型振荡培养箱（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；10 mL、25 mL、50 mL 玻璃容量瓶（BRAND Germany 公司，A 类）；5 mL、15 mL 单标线玻璃吸量管（SCRC公司，A类）。
1.2 试药
碳酸钙D3颗粒（Ⅱ）（批号为20210403J），混合辅料，均购自A 企业；维生素D3对照品（中国食品药品检定研究院，批号为100061-202110，含量为100.0%）；二甲基亚砜、正己烷、异丙醇（色谱纯，德国Merck 公司）；水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
避光操作。色谱柱：SIGMAALDRICH SUPELCOSIL LC-SI 柱（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：A 为异丙醇-正己烷（0.45∶100，V/V），B 为异丙醇-正己烷（20∶80，V/V），梯度洗脱（程序见表1）；流速：1.0 mL/min；检测波长：265 nm；柱温：30 ℃；进样量：40µL。
表1 流动相梯度洗脱程序（%）Tab.1 Gradient elution program of the mobile phase（%）
2.2 溶液制备
对照品溶液：取维生素D3对照品20 mg，精密称定，置100 mL 容量瓶中，加稀释溶剂（75%二甲基亚砜水溶液1 mL，正己烷20 mL，振摇，静置，取正己烷层）溶解并定容，摇匀；精密量取5 mL，置100 mL容量瓶中，加稀释溶剂溶解并定容，摇匀；精密量取5 mL，置100 mL 容量瓶中，加稀释溶剂溶解并定容，摇匀，即得。
供试品溶液：取20粒样品内容物，混匀，研细，精密称取细粉（相当于维生素D36.25µg），加75%二甲基亚砜水溶液20 mL，45 ℃水浴超声（功率为500 W）提取15 min，放冷，精密加入稀释溶剂15 mL，密塞，置振荡培养箱（转速为200 r/min）中振摇萃取90 min，离心（转速为3 000 r/min）10 min，取上清液，即得。
2.3 数学模型建立
根据公式（1）建立数学模型。式中，C为样品中维生素D3的含量（%）；AS为供试品溶液中维生素D3的校正峰面积；MR为对照品称样量（mg）；PR为对照品含量（%）；VS为样品稀释倍数；W为样品平均装量（g）；AR为对照品溶液中维生素D3的校正峰面积；MS为样品称样量（g）；VR为对照品稀释倍数；Q为维生素D3标示量（mg）。
2.4 相对不确定度计算
2.4.1 对照品对不确定度的贡献［urel（R）］
1）对照品纯度的相对标准不确定度［urel（PR）］
对照品说明书无不确定度相关信息，按其置信区间α为± 0.05%、P为100%计［10］，视为矩形分布，则urel（PR）=0.05%÷÷100%=0.000 289。
2）对照品称量引入的相对标准不确定度［urel（MR）］
分别取维生素D3对照品20.44 mg 和20.14 mg，精密称定，平行制备2 份对照品溶液。称量过程中引入的不确定度有3个主要来源：（1）天平校准。依据天平的校准证书，天平检定分度（e）值为0.1 mg，在0～5 g 量程内，最大允许误差为±0.5e，即±0.05 mg，视为矩形分布（k=），则天平校准引入的标准不确定度为0.05 ÷=0.02 89 mg。（2）天平分辨率。所用电子天平最小有效数字为0.01 mg，视为矩形分布（k=），则分辨率引入的标准不确定度为0.01÷2÷=0.002 89 mg。（3）称量重复性。称量时重复性最大允许误差为1.5e，即0.15 mg，视为矩形分布（k=），则重复性引入的不确定度为0.15÷=0.086 6 mg。单次称量的相对标准不确定度为=0.0913 mg。天平共称量2 次（对照品和纸重各1 次），故2 次称量的相对标准不确定度为=0.129 mg。则urel(MR)==0.008 99。
3）对照品溶液制备引入的相对标准不确定度［urel（VR）］
配制对照品溶液过程引入的不确定度主要有吸量管（A 级）校准不确定度、容量瓶（A 级）校准不确定度和温差导致溶液膨胀的不确定度。依照JJF1059.1-2012［9］和JJF1135-2005［11］的要求，吸量管、容量瓶的不确定度的估算应按三角分布（k=）。20 ℃正己烷体积膨胀系数为1.36×10-3mL/℃［12］，设实验室的温度在±4 ℃范围内变动，取波动最大值4 ℃，温差导致溶液体积膨胀视为矩形分布（k=）。吸量管及容量瓶的容量允许误差［13-14］见表2，各分量不确定度见表3。对照品溶液制备过程中，使用5 mL 单标线吸量管2 次，使用100 mL 容量瓶3 次，根据表3 中各分量的结果，得urel(VR)==0.007 27。
表2 容量允许误差（mL）Tab.2 Admissible error of volume（mL）
表3 各分量不确定度Tab.3 Uncertainty of each weight
4）对照品溶液测定引入的相对标准不确定度［urel（AR）］
对照品溶液测定的峰面积受进样量重复性、泵流速稳定性、分离度重复性、组分在色谱柱等滞留变化、检测器稳定性、积分变动性等随机变化的影响，可合并为进样重复性［15］。按外标法测定，通常平行制备2份对照品溶液，分别进样5次和2次。因此，采用极差法［10］计算每份对照品溶液测定的相对标准不确定度，则urel(AR)==0.004 67。详见表4。
5）对照品引入的相对标准不确定度［urel（R）］
urel(R)==0.012 5。
2.4.2 样品对不确定度的贡献［urel（S）］
1）样品称量引入的相对标准不确定度urel（MS）
分别取样品细粉4 003.57 mg 和4 013.15 mg，精密称定，平行制备2份供试品溶液，称量过程中引入的不确定度来源与对照品一致，即天平校准、天平分辨率和称量重复性。样品称量使用的天平与对照品一致，则urel(MS)==0.000 045 5。
2）供试品溶液制备的相对标准不确定度［urel（VS）］
制备供试品溶液过程引入的不确定度来源分别为吸量管校准不确定度和温差导致溶液膨胀的不确定度。供试品溶液制备过程中，使用15 mL 单标线吸量管1次，由表3可知，urel(VS)=0.003 21。
3）样品平均装量引入的相对标准不确定度［urel（W）］
取样品20粒，精密称定质量，倾出内容物，囊壳用棉签拭净，再精密称定囊壳质量，求得平均装量。平均装量引入的不确定度来源为天平称量的不确定度，称量使用的天平与对照品一致，20粒胶囊总质量为73 074.01 mg，20 粒囊壳总质量为11 446.13 mg，则urel(W)==0.000 011 4。
4）供试品溶液测定引入的相对标准不确定度［urel（AS）］
平行制备2 份供试品溶液，各进样1 次，维生素D3含量为70.32%和71.19%，标准偏差（S）为0.006 15，根据标准不确定度A 类评定方法［3］，则urel(AR)=0.006 15÷=0.004 35。
5）样品引入的相对标准不确定度［urel(S)］
urel(S)==0.005 41。
2.4.3 高效液相色谱仪对不确定度的贡献［urel（I）］
经查校准证书可知，高效液相色谱仪紫外检测器定量测量重复性为0.1%，视为矩形分布（k=），则urel(I)=0.1%÷=0.000 577。
2.4.4 方法偏倚对不确定度的贡献［urel（B）］
分析方法的偏倚表示为分析回收率。采用加样回收试验法，制备相当于供试品溶液浓度60%，100%，160%的回收样品，各3份，回收率测定结果见表5。方法偏倚的标准不确定度为urel(B)=4.60%÷=1.53%，则urel(B)=1.53%÷83.82%=0.018 3。
表5 加样回收试验测定结果（%，n=9）Tab.5 Results of the recovery test（%，n=9）
2.5 不确定度评定
计算方法的合成不确定度［uC（C）］为uC(C)==0.022 8。测得样品中维生素D3平均含量为70.76%，则uC（C）=0.022 8×70.76%=1.61%。取扩展因子k=2，此时置信概率为95%，则扩展不确定度为U95=kuC（C）=2 ×1.61%=3.22%。由表6 可知，影响该方法结果准确度的主要因素为方法偏倚。
表6 相对标准不确定度评定结果Tab.6 Evaluation results of relative standard uncertainty
3 讨论
采用《国家药品标准》WS1-XG-033-2021 中维生素D3含量测定方法测定碳酸钙D3颗粒（Ⅱ）中维生素D3，结果表示为（70.76±3.22）%，置信概率为95%，k=2。本研究中分析了不确定度的来源，计算各分量不确定度，并对结果进行综合评定，碳酸钙D3颗粒（Ⅱ）中维生素D3含量测定的不确定度贡献主要来源于方法偏倚。该方法回收率较低，三水平回收样品的平均回收率仅为83.82%，相对标准偏差（RSD）为4.60%（n=9）。建议对该方法进行影响因素试验考察，制订准确、可靠的检验方法，提高平均回收率至98.0%～102.0%，RSD≤1.5%（n=9），以保证该方法检测结果的准确性。
