蓝靛果多酚提取物保肝、保肾的药效研究

杨智惠,李嘉欣,王金宏,宋 辉,宗 政,胡 扬,李文兰

(哈尔滨商业大学 药学院,哈尔滨 150076)

蓝靛果(LoniceracaeruleaL.)又称黑瞎子果、山茄子等,是一种落叶灌木植物,属于忍冬科忍冬属[1-2].其味苦性凉,可清热泻火、散痈消肿,可治疗乳痈、肠痈、丹毒等热毒疮疡症,同时也可用于湿热痢疾、大便赤白等症,具有较高的营养以及医疗保健价值[3].蓝靛果中富含多酚、矿物质元素、有机酸、维生素等多种与人类健康密切相关的物质[3],其主要成分包括多酚类(花青素、原花青素、花色苷、酚酸类、类黄酮类)、多糖类、有机酸等[4].多酚类成分是一类具有多个羟基苯环的化合物,常见于植物中,具有广泛的生物活性和药理作用.其主要作用机制包括抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗衰老、保肝护肝和免疫调节等作用[5-7].在抗氧化方面,多酚类成分中羟基结构能够捕捉自由基,使其羟基产生病理变化,达到清除自由基的目的[8].在抗炎方面,多酚类成分通过抑制炎症因子的产生和发挥抗氧化作用来减轻炎症反应和组织损伤[9].在抗肿瘤方面,多酚类成分能够通过增强染色体修复能力和机体免疫力来抑制癌细胞的增生,提高人体抗癌能力[10-11].在抗衰老方面,多酚类成分能够提高细胞自我修复能力,延缓细胞衰老和机体老化进程[12].在保肝护肝方面,蓝靛果对肝炎症和肝细胞过氧化具有正向调节作用,另外对脂多糖诱导的大鼠肝源性细胞(BRL-3A)有保护作用[13],对CCl4导致的肝损伤也有一定的保护作用[14].因此,多酚类成分被广泛应用于中药、保健食品和化妆品等领域.

本文采用超声法提取蓝靛果中的多酚成分,以四氯化碳(CCl4)和顺铂诱导的急性肝损伤、急性肾损伤小鼠为研究对象,探究蓝靛果多酚提取物的保肝保肾作用,为蓝靛果多酚提取物保肝保肾作用提供理论依据,对蓝靛果相关健康产品的研发和临床应用具有重要意义.

1 仪器与试剂

1.1 仪器

UV-5800紫外-可见分光光度仪(上海元析仪器有限公司);680型全自动酶标仪(美国BIO-RAD公司);电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);FDU-1200冷冻干燥机(上海爱郎仪器有限公司);Neofuge 13R高速冷冻离心机(上海力申科学仪器有限公司).

1.2 药材、试剂与动物

蓝靛果(大兴安岭超越野生浆果开发有限责任公司);95%乙醇(分析纯,津东天正化学试剂厂,批号:20190807);福林-酚(上海国药试剂集团,批号:20180423);没食子酸(上海源叶生物科技有限公司,批号:C17D10C105977);四氯化碳(上海麦克林试剂有限公司,批号:C11812393);水飞蓟素胶囊(德国马博士大药厂,批号:H20190115);顺铂(齐鲁制药有限公司,批号:1C0166B03);醋酸地塞米松片(遂成药业股份有限公司,批号:20190901);A045-2-2 TP试剂盒,批号20210719;A028-2-1 ALB试剂盒,批号20210719;C009-2-1 ALT试剂盒,批号20210721;C010-2-1 AST试剂盒,批号20210721;C019-1-1 TBIL试剂盒,批号20210723;C019-2-1 DBIL试剂盒,批号20210723;A006-2-1GSH试剂盒,批号20210724;A005-1-2 GSH-Px试剂盒,批号20210724;A003-1-2 MDA试剂盒,批号20210725;A001-3-2 SOD试剂盒,批号20210725;A013-2-1 BUN试剂盒,批号20210823;A011-2-1 CRE试剂盒,批号20210823;C002-1-1 Na+试剂盒,批号20210815;C004-2-1 Ca2+试剂盒,批号20210814;C005-1-1 Mg2+试剂盒,批号20210824;C003-2-1 Cl-试剂盒,批号20210823;C001-2-1K+试剂盒,批号20210813;C012-2-1UA试剂盒,批号20210822,以上试剂盒均购自于南京建成生物工程研究所.

SPF级KM小鼠(长春市亿斯实验动物技术有限责任公司), 20～22 g, 自由饮水,适应性饲养1周后进行实验.

2 实验方法

2.1 蓝靛果多酚提取物的制备

将蓝靛果鲜果粉碎后冷冻干燥,称取蓝靛果冻干品,50%乙醇进行提取,采用1∶15的料液比,以40 ℃的温度进行提取,每次提取持续90 min,重复浸提2次,抽滤,合并提取液,即为多酚粗提液[15].采用大孔树脂 (AB-8型大孔树脂)静态吸附方法[16],选择pH值为7的95%乙醇,吸附时间为2 h,解吸平衡时间为40 min,得其精提物(得率为50.5%).

2.2 小鼠肝损伤实验

2.2.1 分组、造模及样品采集

将小鼠适应喂养7 d后,分为空白组(腹腔注射1 mL/kg橄榄油)、模型组(腹腔注射5% CCl4)、阳性对照组(灌胃0.1 mg/g bw水飞蓟素)、蓝靛果多酚提取物低中高剂量组(0.025、0.05、0.1 mg/g bw),每组10只.

在使用CCl4造模前,预先动物灌胃给药蓝靛果多酚提取物、水飞蓟素干预14 d,末次给药后,除空白对照组之外,其余小鼠均腹腔注射5%油溶CCl4,经过24 h的造模后,从小鼠眼球中取血,将血液收集于1.5 mL离心管内.样本在室温下静置20 min后,置于4 ℃的冰箱中30 min,在4 ℃条件下以3 000 r/min离心10 min,取上清液保存于-80 ℃的冰箱中.将小鼠颈椎脱臼处死,在适宜条件下保存血液、肝、脾组织并取样.

2.2.2 生物学指标检测

对CCl4诱导的肝损伤小鼠进行生物学指标检测:1)肝组织病理形态学检查:取出肝组织,经过脱水等操作后在显微镜下观察记录组织形态并拍照;2)脏器指数的测定:计算各组小鼠的脏器指数;3)小鼠血清生化指标的测定:取小鼠血清样品,选择相应ELISA试剂盒测定各组小鼠的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血清总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)水平;4)小鼠氧化应激指标的测定:取小鼠肝匀浆样品,选择相应ELISA试剂盒测定各组小鼠的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平.

2.3 小鼠肾损伤实验

2.3.1 分组、造模及样品采集

将小鼠适应性饲养3 d后.分为空白组(腹腔注射0.001 mL/g生理盐水)、模型组(腹腔注射0.02 mg/g顺铂),阳性对照组(灌胃0.004 mg/g bw地塞米松)、蓝靛果多酚提取物低中高剂量组(0.025 mg/g bw、0.05 mg/g bw、0.1 mg/g bw),每组10只.

在使用顺铂造模前,预先动物灌胃给药蓝靛果多酚提取物、地塞米松干预14 d,末次给药后,除空白对照组之外,其余小鼠均腹腔注射顺铂0.02 mg/g,造模48 h后,分别取血液、肝、脾组织,操作同2.2.1.

2.3.2 生物学指标检测

对顺铂诱导的肾损伤小鼠进行生物学指标检测:1)肝组织病理形态学检查.取出肝组织,经过脱水等操作后在显微镜下观察记录组织形态并拍照;2)脏器指数的测定.计算各组小鼠的脏器指数;3)小鼠血清生化指标的测定.取小鼠血清样品,选择相应ELISA试剂盒测定各组的血清尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、镁离子(Mg2+)、钾离子(K+)、钙离子(Ca2+)、氯离子(Cl-)、钠离子(Na+)、尿酸(UA)水平;4)小鼠氧化应激指标的测定.取小鼠肝匀浆样品,选择相应ELISA试剂盒测定各组小鼠的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平.

2.4 统计学处理

采用SPSS24.0软件对数据进行统计分析.

3 实验结果

3.1 蓝靛果多酚提取物对肝损伤小鼠的影响

3.1.1 蓝靛果多酚提取物对肝损伤小鼠肝组织病理形态学的影响

显微镜下观察各组小鼠肝脏HE染色切片,结果表明蓝靛果多酚提取物能够改善CCl4导致的肝结构损伤.见图1、表1.

表1 各组小鼠肝脏HE染色切片分析Table 1 Analysis of liver HE staining sections in each group of mice

图1 各组小鼠HE染色结果(×400)Figure 1 HE staining results of mice in each group (×400)

3.1.2 蓝靛果多酚提取物对肝损伤小鼠脏器指数的影响

通过对小鼠脏器指数参数进行统计分析,结果表明,蓝靛果多酚提取物对CCl4所致小鼠肝损伤具有一定的保护作用.与模型组相比,蓝靛果多酚提取物低剂量组肝脏指数略降低,脾脏指数略升高,均无显著性差异(P>0.05);蓝靛果多酚提取物中剂量组肝脏指数略降低,无显著性差异(P>0.05),脾指数明显升高,有显著性差异(P<0.05);蓝靛果多酚提取物高剂量组肝脏指数明显降低,有显著性差异(P<0.05),脾脏指数明显升高, 有极显著性差异(P<0.01), 见图2.

图2 蓝靛果多酚提取物对小鼠肝脏、脾指数的影响Figure 2 Effect of Lonicera caerulea polyphenol extract on liver, spleen index in mice

3.1.3 蓝靛果多酚提取物对肝损伤小鼠血清肝生化指标的影响

通过对小鼠血清生化参数进行统计分析,结果表明蓝靛果多酚提取物可改善CCl4所致肝损伤小鼠肝细胞合成能力.与模型组相比,蓝靛果多酚提取物低剂量组TP、ALB略升高,无显著性差异(P>0.05);蓝靛果多酚提取物中剂量组TP略升高,无显著性差异(P>0.05),ALB明显升高,有显著性差异(P<0.05);蓝靛果多酚提取物高剂量组TP、ALB明显升高,有极显著性差异(P<0.01),见图3.

图3 蓝靛果多酚提取物对小鼠血清TP、ALB的影响Figure 3 Effect of Lonicera caerulea polyphenol extract on serum TP,ALB in mice

通过对小鼠血清生化参数进行统计分析,结果表明蓝靛果多酚提取物可改善CCl4所致肝损伤小鼠肝脏代谢排毒功能.与模型组相比,蓝靛果多酚提取物低剂量组TBIL、DBIL略降低,无显著性差异(P>0.05);蓝靛果多酚提取物中剂量组DBIL略降低,无显著性差异(P>0.05),TBIL明显降低,有显著性差异(P<0.05);蓝靛果多酚提取物高剂量组TBIL、DBIL明显降低,有显著性差异(P<0.05),见图4.

图4 蓝靛果多酚提取物对小鼠血清TBIL、DBIL的影响Figure 4 Effect of Lonicera caerulea polyphenol extract on serum TBIL, DBIL in mice

通过对小鼠血清生化参数进行统计分析,结果表明蓝靛果多酚提取物可以缓解CCl4所致肝损伤小鼠肝细胞的损伤.与模型组相比,蓝靛果多酚提取物低剂量组ALT 、AST略降低,无显著性差异(P>0.05);蓝靛果多酚提取物中剂量组ALT、AST明显降低,有显著性差异(P<0.05);蓝靛果多酚提取物高剂量组AST、ALT明显降低,有极显著性差异(P<0.01),见图5.

图5 蓝靛果多酚提取物对小鼠血清ALT、AST的影响Figure 5 Effect of indigo polyphenol extract on serum ALT, AST in mice

3.1.4 蓝靛果多酚提取物对肝损伤小鼠肝抗氧化指标的影响

通过对小鼠肝脏抗氧化参数进行统计分析,结果表明蓝靛果多酚提取物可以缓解细胞氧化损伤、提高机体清除自由基的能力.与模型组相比,蓝靛果多酚提取物低剂量组MDA略降低,GSH、SOD、GSH-Px略升高,均无显著性差异(P>0.05);蓝靛果多酚提取物中剂量组MDA明显降低,GSH、SOD、GSH-Px明显升高,均有显著性差异(P<0.05);蓝靛果多酚提取物高剂量组MDA明显降低,GSH、SOD、GSH-Px明显升高,均有极显著性差异(P<0.01),见图6.

图6 蓝靛果多酚提取物对小鼠肝组织GSH、SOD、GSH-Px、MDA的影响Figure 6 Effect of Lonicera caerulea polyphenol extract on liver tissue GSH, SOD, GSH-Px, MDA in mice

3.2 蓝靛果多酚提取物对肾损伤小鼠的影响

3.2.1 蓝靛果多酚提取物对肾损伤小鼠肾组织病理形态学的影响

显微镜下观察各组小鼠肾脏HE染色切片,结果表明蓝靛果多酚提取物可降低肾损伤程度,改善肾细胞变性、肿胀等病理现象,见图7、表2.

表2 各组小鼠肾脏HE染色切片分析Table 2 Analysis of renal HE staining sections in each group of mice

图7 各组小鼠HE染色结果(×400)Figure 7 HE staining results of mice in each group (×400)

3.2.2 蓝靛果多酚提取物对肾损伤小鼠脏器指数的影响

通过对小鼠脏器指数的统计分析,结果表明在一定程度上,蓝靛果多酚提取物可保护顺铂导致的小鼠急性肾损伤.与模型组相比,蓝靛果多酚提取物低剂量组肾脏指数略降低,脾脏指数略升高,均无显著性差异(P>0.05);蓝靛果多酚提取物中剂量组肾脏指数略降低,无显著性差异(P>0.05),脾脏指数明显升高,有显著性差异(P<0.05);蓝靛果多酚提取物高剂量组肝脏指数明显降低,脾脏指数明显升高,均有极显著性差异(P<0.01),见图8.

图8 蓝靛果多酚提取物对小鼠肾脏、脾指数的影响Figure8 Effect of Lonicera caerulea polyphenol extract on kidney, spleen index in mice

3.2.3 蓝靛果多酚提取物对肾损伤小鼠血清肾生化指标的影响

通过对小鼠血清生化参数进行统计分析,结果表明在一定程度上,蓝靛果多酚提取物可保护顺铂导致的小鼠急性肾损伤.模型组相比,蓝靛果多酚提取物低剂量组BUN、CRE、UA略降低,无显著性差异(P>0.05);蓝靛果多酚提取物中剂量组CRE、BUN明显降低,有显著性差异(P<0.05),UA明显降低,有极显著性差异(P<0.01);蓝靛果多酚提取物高剂量组BUN、CRE、UA明显降低,有极显著性差异(P<0.01),见图9.

图9 蓝靛果多酚提取物对小鼠血清BUN、CRE、UA的影响Figure 9 Effect of Lonicera caerulea polyphenol extract on serum BUN,CRE,UA in mice

通过对小鼠血清生化参数进行统计分析,结果表明在一定程度上,蓝靛果多酚提取物可保护顺铂导致的小鼠急性肾损伤.与模型组相比,蓝靛果多酚提取物低剂量组K+、Cl-略降低,Mg2+、Ca2+、Na+略有升高,均无显著性差异(P>0.05);蓝靛果多酚提取物中剂量组K+、Cl-明显降低,Ca2+明显升高,均有显著性差异(P<0.05),Mg2+、Na+明显升高,有极显著性差异(P<0.01);蓝靛果多酚提取物高剂量组K+、Cl-明显降低,Mg2+、Ca2+、Na+明显升高,均有极显著性差异(P<0.01),见图10.

图10 蓝靛果多酚提取物对小鼠血清Mg2+ 、K+、Ca2+、 Cl- 、Na+的影响Figure 10 Effect of Lonicera caerulea polyphenol extract on serum Mg2+, K+, Ca2+, Na+, Cl- in mice

3.2.4 蓝靛果多酚提取物对肾损伤小鼠肾抗氧化指标的影响

通过对小鼠肾脏抗氧化参数进行统计分析,结果表明,蓝靛果多酚提取物可以缓解细胞氧化损伤,对顺铂导致的小鼠急性肾损伤具有一定的保护作用.与模型组相比,蓝靛果多酚提取物低剂量组MDA略降低,GSH、SOD、GSH-Px略升高,均无显著性差异(P>0.05);蓝靛果多酚提取物中剂量组MDA明显降低,SOD明显升高,均有显著性差异(P<0.05),GSH-Px明显升高,有极显著性差异(P<0.01),GSH略升高,无显著性差异(P>0.05);蓝靛果多酚提取物高剂量组MDA明显降低,GSH、SOD、GSH-Px明显升高,均有极显著性差异(P<0.01),见图11.

图11 蓝靛果多酚提取物对小鼠肾组织GSH、SOD、GSH-Px、MDA的影响Figure 11 Effect of Lonicera caerulea polyphenol extract on GSH, SOD, GSH-Px,MDA in kidney tissue of mice

4 讨 论

肝、肾是人体重要代谢组织器官,极易受到外在因素的损伤.急性肝损伤和急性肾损伤是两种常见的临床疾病,其发病率较高,并且治疗和护理工作面临很大的挑战.而蓝靛果是一种具有多种药用和食用价值的中药材,具有抗氧化、抗炎、保肝保肾等多种药理作用.近年来,蓝靛果的应用备受国内外学者关注,研究方向主要集中在提取方法的优化和抗氧化相关的体外实验,但是体内研究较少,尤其是蓝靛果在中药复方中的应用研究更为缺乏,同时其有效成分的提取和纯化技术难度较大,需要进一步的探索和研究.因此在本研究中,采用单剂量腹腔注射CCl4和顺铂分别构建小鼠急性肝损伤、急性肾损伤模型,蓝靛果多酚提取物灌胃后,有效缓解急性肝损伤、急性肾损伤小鼠的肝、肾组织病理性顺损伤.同时降低肝脏指数、肾脏指数,有效缓解细胞的氧化损伤程度,提高机体清除自由基的能力,调节肝、肾功能,对急性肝损伤、急性肾损伤具有保护作用,因此蓝靛果及其多酚提取物在肝肾疾病的预防、治疗方面具有一定的作用,能够为蓝靛果多酚提取物保肝保肾作用的深入研究以及蓝靛果健康产品的研发和临床应用提供理论依据.