不同产地半夏药材HPLC特征图谱的建立

吴建明 华 杰 丁京伟 朱 婷 叶志学

浙江维康药业股份有限公司，浙江 丽水 323000

半夏(Pinelliae Rhizoma)为天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.的干燥块茎。夏、秋二季采挖，洗净，除去外皮和须根，晒干。具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效。用于湿痰寒痰、咳喘痰多、痰饮眩悸、风痰眩晕、痰厥头痛、呕吐反胃、胸脘痞闷、梅核气；外治痈肿痰核[1]。现代学者[2-5]已从半夏中分离得到多种类型化学成分，其中具有生物活性的成分主要包括生物碱类、有机酸类、挥发油类、黄酮类、甾体类和糖类等。现代药理研究[2，6-8]表明，半夏除对呼吸系统、消化系统、循环系统有不同程度的影响外，还具有抗肿瘤、抗早孕、镇痛、镇静和催眠的作用。

半夏产地全国分布较多，直到民国除山东外，半夏似未真正形成大宗的道地产区，民国时期半夏以湖北荆州，浙江富阳、衢州、严州等为道地产地，现代产地较多，半夏大规模人工栽培，湖北、甘肃、四川、贵州、云南、安徽、河北、河南、湖南等省均有大面积种植，以湖北潜江、天门、京山、江陵、襄阳、钟祥等地产半夏质量较佳[9-10]。

中药指纹图谱是目前中药产品质量控制主要手段之一，可更全面地反映中药产品整体特征[11]，目前指纹图谱研究常用高效液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法等[12]。2020年版《中国药典》半夏药材标准中控制的质量属性有性状、鉴别、检查、浸出物定等，缺乏整体控制手段，故拟对其关键质量属性主要化学成分(指纹图谱)控制进行相关试验研究。本试验收集了不同产地的半夏药材，探索采用高效液相色谱-二极管阵列检测器对其进行专属性鉴别，再分别对色谱条件及供试品溶液制备方法进行考察，建立了半夏药材HPLC指纹图谱，为更好地控制半夏药材质量提供了可靠的方法依据。

1 材料与仪器

1.1 材料 鸟苷对照品(批号：PS010291，成都普思生物科技股份有限公司)；腺苷对照品(批号：PS001227，成都普思生物科技股份有限公司)；夏佛塔苷对照品(批号：PS000955，成都普思生物科技股份有限公司)。半夏药材(J20021701、山东省菏泽市郓城县；J20021702、山东省菏泽市郓城县；J20022002、湖北荆门市京山县；J20030301、甘肃省陇南市西和县；J20030901、甘肃省陇南市西和县；J20031001、甘肃省陇南市西和县；J20032001、甘肃省陇南市西和县；J20032002、甘肃省陇南市西和县；J20032501、贵州省毕节市赫章县；J20033001、四川省南充市南部县；J20033002、四川省南充市南部县；J20040701、湖北省荆门市钟祥县；J20040801、甘肃省陇南市西和县；J20062801、湖北荆门市京山县；J20062802、湖北荆门市京山县；J20081201、甘肃省陇南市西和县；J20081202、甘肃省陇南市西和县)，均购自浙江惠松制药有限公司)。甲醇【色谱纯，批号：186347，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)】；乙醇(分析纯，批号：20191011)、甲醇(分析纯，批号：20190912)、甲酸(分析纯，批号：1801089)、磷酸(分析纯，批号：20191015)，均购自国药集团化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 取鸟苷、腺苷、夏佛塔苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成浓度分别为0.02 mg/mL的溶液，即得。

2.2 供试品溶液的制备 取半夏药材适量粉碎，过四号筛(65目)，取约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水20 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min(功率900 W，频率60 kHz)，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件与系统适用性试验 SVEA C18Opal 型色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以甲醇为流动相A，以水为流动相B，按表1进行梯度洗脱；柱温为30 ℃；流速为0.9 mL/min；检测波长为270 nm。

表1 半夏药材HPLC特征图谱梯度洗脱表

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验 取空白(甲醇)、鸟苷、腺苷、夏佛塔苷、半夏药材J20032002，按“2.2”“2.3”项下方法制备对照品溶液和供试品溶液，按照“2.4”项下色谱条件进样检测分析。结果如图1所示。结果表明，空白溶剂未在供试品色谱相应位置出峰，供试品色谱中含有与鸟苷、腺苷、夏佛塔苷对照品保留时间且紫外吸收光谱一致的峰(详见表2)，说明该方法专属性良好。

从下至上依次为：空白(甲醇)、鸟苷、腺苷、夏佛塔苷、半夏药材J20032002供试品

表2 对照品与半夏药材供试品紫外图谱吸收

2.4.2 精密度试验 取半夏药材J20032002，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.4”项下色谱条件连续进样5针，每次进样10 μL，将得到5针指纹图谱以AIA格式依次导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》计算软件进行分析，参数设置为：以试验第一个样色谱图为参照图谱，生成方法中位数，时间窗0.1；多点校正；全峰匹配，计算相似度结果，并对指纹图谱中10个明显特征峰进行标记，计算9个标记峰与标记S峰(鸟苷)的相对保留时间及相对峰面积。如图2所示。

从下至上依次为：精密度1、精密度2、精密度3、精密度4、精密度5

结果表明，连续进样的5针供试品溶液指纹图谱相似度均大于0.99，各供试品溶液与对照指纹图谱之间的相似度均大于0.99，各特征峰的峰相对保留时间RSD均小于1.0%，除峰9外，各特征峰相对峰面积小于10.0%，其中峰9由于受基线噪音影响，导致其相对峰面积RSD较大。综合分析，该方法仪器精密度良好。

在对企业工程领域法律风险源进行全面摸排调查，并分析评估内外部法律环境基础上，形成了全面覆盖工程各环节的法律风险防控模式，法律风险防范工作实现了由事后救济型向事先预防、过程控制型转变。其基本内涵是：通过组织机制建设，构建工程法律风险管理体制；通过点线面的联动机制和流程再造，实现法律风险防控程序化；通过法律风险防控与基层业务的融合、多重管理机制管理手段相结合，构建全面风险管理体系，实现法律风险防控同制度创新、技术创新的融合。为构建工程法律风险全过程全方位防控模式，企业的主要做法是：

2.4.3 重复性试验 取半夏药材J20032002，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.4”项下色谱条件各进样10 μL，将得到的指纹图谱以AIA格式依次导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》计算软件进行分析，参数设置为：以试验第一个样色谱图为参照图谱，生成方法中位数，时间窗0.1；多点校正；全峰匹配，计算相似度结果，计算9个标记峰与标记S峰(鸟苷)的相对保留时间及相对峰面积。如图3所示。

从下至上依次为重复性1、重复性2、重复性3、重复性4、重复性5、重复性6

结果表明，6个供试品呈现出的色谱相似度均大于0.99，各供试品溶液与对照指纹图谱之间的相似度均大于0.99，各特征峰(同精密度项下)相对保留时间RSD均小于1.0%；除峰9外，其余各特征峰相对峰面积小于10.0%，其中峰9由于受基线噪音影响，导致其相对峰面积RSD较大。综合分析，该方法重复性良好。

2.4.4 溶液稳定性试验 取半夏药材J20032002，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别在0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h按照“2.4”项下色谱条件各进样10 μL进样检测，将得到的指纹图谱以AIA格式依次导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》计算软件进行分析，参数设置为：以0 h色谱图为参照图谱，生成方法中位数，时间窗0.1；多点校正；全峰匹配，计算相似度结果，计算9个标记峰与标记S峰(鸟苷)的相对保留时间及相对峰面积。如图4所示。

从下至上依次为：0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h

结果表明，不同时间点测得的色谱相似度均大于0.99，各时间点供试品溶液与对照指纹图谱之间的相似度均大于0.99，各特征峰(同精密度项下)相对保留时间RSD均小于1.0%，相对峰面积RSD均小于10.0%，该供试品溶液在常温放置8 h内稳定性良好。

2.5 指纹图谱的差异分析 按照“2.4”项下色谱条件，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，对17批半夏药材供试品溶液进行指纹图谱检测，将得到的指纹图谱以AIA格式依次导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》计算软件进行分析，参数设置为：数据剪切0～5 min以及 45 min，以S1(J20021701)为参照图谱，生成方法中位数，时间窗0.1；多点校正11个峰；全峰匹配，计算相似度结果，生成对照指纹图谱如图5。比较各批次样品指纹图谱的相似度、共有峰相对峰面积等差异，评价不同批间样品的质量差异。

图5 17批半夏药材特征图谱

S1-S17依次为J20021701、J20021702、J20022002、J20030301、J20030901、J20031001、J20032001、J20032002、J20032501、J20033001、J20033002、J20040701、J20040801、J20062801、J20062802、J20081201、J20081202

相似度结果显示，17批半夏药材之间相似度在0.715～1.000之间，17批药材分别与拟合的对照指纹图谱的相似度结果在0.869～0.990范围内。

选择占总峰面相对较大(占总峰面积2%)、响应值较高、分离度较好的共有峰作为特征峰，经评估，半夏药材对照指纹图谱中不低于总峰面积2%共有色谱峰有9个，分别为共有峰2、3、4、5、6、8、9、10、11，并以这9个共有峰作为特征峰，统计各特征峰的相对保留时间与峰面积。结果如图6所示，见表3～5。

表3 对照指纹图谱共有峰占总峰面积比例

表4 特征峰相对保留时间

表5 特征峰相对峰面积

3 讨论

不同来源的半夏药材由于受产地、种植、采收、贮藏等影响致使其所含的有效成分的含量具有一定的差别，从而影响了临床疗效[13]。指纹图谱能够反映出待测样品的整体性、特征性，通过建立指纹图谱，对半夏药材中多种有效成分进行控制，保证药材质量均一性和稳定性。

首先根据半夏化学成分组成、处方药味的制备方法选择高效液相色谱-二极管阵列检测器，再分别对色谱条件及供试品溶液制备方法进行考察，初步确定指纹图谱研究用色谱条件。

3.1 供试品溶液制备方法选择 以色谱峰个数、整体分布呈现等为指标，采用超声处理30 min的方式，对供试品溶液提取溶媒进行了研究。先对比70%乙醇、95%乙醇、甲醇、水超声提取所得色谱峰差异进行判断，再根据结果考察20%甲醇、50%甲醇、水超声提取所得指纹图谱。结果表明，在同一洗脱条件下，以水为提取溶媒时，指纹图谱色谱峰个数、整体分布及部分峰分离情况更好，故选择水作为提取溶媒。

3.2 检测波长确定 结合确定的方法所测半夏指纹图谱的3D图(时间-波长-响应值)分析可知，230～290 nm波长呈现的色谱峰相对较多，对比不同波长下指纹图谱可知，270 nm波长下呈现的色谱峰响应值更高，各峰分布较为均匀，整体谱图呈现良好，故选择270 nm为半夏指纹图谱检测波长。

3.3 流动相的考察研究 通过查阅大量半夏药材高效液相色谱指纹图谱方法研究，初步以甲醇-水为流动相，并且对比“甲醇-水”与“甲醇-0.1%甲酸”“甲醇-0.1%磷酸”分别作为流动相体系时半夏指纹图谱呈现情况。结果显示，不同流动相体系，色谱峰个数及响应值均存在差异，其中以甲醇-水为流动相时洗脱出的色谱峰信息更多且部分色谱峰分离度更好，故暂选“甲醇-水”作为半夏指纹图谱流动相体系。以“甲醇-水”流动相体系进行洗脱程序的优化，最终确定流动相为以甲醇为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱。

3.4 特征峰的确认 根据17批次半夏药材指纹图谱直观分析，可知各批次相应较大色谱峰个数基本一致，但不同批次相同色谱峰响应值存在差异，尤其是保留时间5～10 min左右色谱峰；由相似度结果可知，17批药材中仅半夏J20030301、J20030901与对照指纹图谱相似度低于0.9，两次均来自甘肃省陇南市西和县，根据相似度结果初步分析两批次与其他质量存在一定差异；各特征峰(S峰除外)相对峰面积RSD值在23.4%～101.7%，除去相似度低于0.9的两批次后，各特征峰(S峰除外)相对峰面积的RSD值在24.9%～70.0%，说明不同批次间特征峰相对保留时间存在较大差异。

17批半夏药材中共有峰11个，统计对照指纹图谱中各共有峰中峰面积占共有峰总峰面积百分比可知，11个共有峰中只有2个峰(峰1、峰7)占总峰面积比值低于2%，考虑到批次间质量化学成分含量存在差异，峰面积较小、分离度较差的共有峰受检测条件等影响较大，不适宜作为特征峰用于药材的质量控制，故选择占总峰面相对较大(占总峰面积2%)、响应值较高、分离度较好的共有峰作为特征峰，经评估，半夏药材对照指纹图谱中不低于总峰面积2%共有色谱峰有9个。

综上分析，不同批次间化学成分种类及含量均存在一定差异，且不同批次间各主要成分的相对含量差异也较大，故半夏药材整体质量评价以主要化学成分的控制，即特征图谱为主，相似度作为参考；根据17批次样品谱图中特征峰的相对保留时间平均值，制定特征图谱的规定值，考虑到仪器、色谱柱等可能会影响色谱峰的保留时间，设置特征峰相对保留时间允许范围为规定值的±10%。

4 结论

以SVEA C18Opal 色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以甲醇—水(梯度洗脱)为流动相；流速为0.9 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为 270 nm，采用HPLC法测定。

建立的半夏特征图谱中共标记9个特征性明显的共有色谱峰，如图7对照特征图谱所示，根据17批次样品谱图中特征峰的相对保留时间平均值，制定特征图谱的规定值，最终确立特征图谱标准为：供试品特征图谱中呈现9个特征峰，与鸟苷参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，应在规定值的±10%之内。相对保留时间规定值为：0.503(峰1)、0.563(峰2)、0.643(峰3)、0.928(峰4)、1.000(峰5)、1.490(峰6)、1.536(峰7)、2.171(峰8)、2.210(峰9)。试验证明，该方法经过方法学验证，结果可靠，可用于半夏药材的质量控制。

峰5(S)：鸟苷；峰7：腺苷；峰9：夏佛塔苷