电针对功能性消化不良大鼠十二指肠CRHR2、NLRP6表达的影响

乐 薇,姚函伶,范建超,徐派的,吴贻森,杨格格

(1.武汉市中西医结合医院针灸科,湖北 武汉 430022;2.湖北中医药大学针灸骨伤学院,湖北 武汉 430061)

功能性消化不良(functional dyspepsia,FD)是较常见的胃十二指肠疾病之一,此类患者无明显的器质性病变,常见症状有进食后饱胀、恶心、上腹部疼痛或上腹部烧灼感等,部分患者可伴发焦虑、抑郁等心理症状[1]。流行病学调查[2]显示,FD全球发病率呈逐年上升趋势,且复发率高,病情复杂,难以治愈。目前,研究多认为FD的发病与内脏高敏性、脑—肠轴功能紊乱、十二指肠炎症等密切相关[3-5],其中十二指肠低度炎症以及黏膜屏障的缺陷是诱发FD的关键因素。研究[6-8]表明,电针是治疗FD的有效疗法,也是当今功能性胃肠疾病的研究热点。本研究通过多因素干预法复制FD大鼠模型,采用电针“印堂”“内关”“足三里”的方法干预FD大鼠,从大鼠一般状态、胃肠动力、胃肠炎症反应和黏膜通透性等方面,探讨电针对FD大鼠十二指肠中促肾上腺皮质激素释放激素受体2(corticotropin-releasing hormone receptor2, CRHR2)及NOD样受体家族pyrin结构域蛋白6(NOD-like receptor family pyrin domain containing 6,NLRP6)表达的影响。

1 材料

1.1 实验动物及分组 40只健康SPF级雄性SD大鼠,体质量(180±20)g,购自三峡大学动物实验中心[动物生产许可证号:SCXK(鄂)2022-0012]。将大鼠喂养于湖北中医药大学SPF级实验动物房,环境温度20～26 ℃,湿度40%～60%,12 h昼夜交替,所有动物均自由摄食、饮水,适应性喂养1周。1周后随机选择10只大鼠作为空白组;剩余30只大鼠采取多因素干预法复制FD大鼠模型,模型复制14 d后随机抽取10只大鼠作为模型组,另外抽取10只大鼠作为电针组。此次研究已通过湖北中医药大学实验动物中心审批(伦理编号:HUCMS202203001),整个实验期间的操作和处理均符合《湖北省动物管理条例》。

1.2 主要试剂 CRHR2抗体(货号 25267-2-AP):武汉三鹰生物技术有限公司;NLRP6抗体(货号 A15628):武汉爱博泰克生物科技有限公司;内参抗体GAPDH(货号 GB12002)、RIPA裂解液(货号 G2002)、BCA试剂盒(货号 G2026)、苏木精—伊红(hematoxylin-eosin,HE)染液套装(货号 G1003):武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.3 主要仪器 台式高速冷冻离心机(型号 D3024R):北京大龙兴创实验仪器有限公司;转印电泳仪(型号 SVT-2)、柯达胶片(型号 WGJP0001):武汉赛维尔生物科技有限公司;灰度分析软件(型号 Innotech):Alpha Innotech。

2 方法

2.1 FD大鼠模型复制 采用多因素干预法[9]复制FD大鼠模型,即改良郭氏夹尾刺激法联合不规则饮食及冰0.9%氯化钠注射液灌胃法。①改良郭氏夹尾刺激法。用自粘绷带呈螺旋状包裹缠绕止血钳,夹取大鼠尾端1/3处,给予大鼠刺激,引诱其与同笼大鼠相互打斗、撕咬。操作期间应及时松开止血钳,避免长时间夹取一个部位,引发尾部缺血坏死。每笼大鼠夹尾30 min,每日2次,下一次夹尾操作需间隔4 h,连续夹尾14 d。夹尾结束后需要对大鼠尾部行常规无菌操作处理,以防尾部感染。②不规则饮食。清除单日剩余的饲料,逢双日禁食;补充无菌水,保证正常饮水。③冰0.9%氯化钠注射液灌胃法。取出提前冰冻的0.9%氯化钠注射液,有少许注射液解冻至流动状态后开始灌胃,每只2 mL,每日2次,共14 d。若大鼠出现少动、喜扎堆、毛发变黄如枯草状、大便稀软甚至呈水糊样、进食量减少、体质量减轻,提示模型复制成功。

2.2 干预方法 电针组于模型复制结束后第2天开始给予电针干预,选取“印堂”(两眼眶上缘最高点连线的中点)、“内关”(前肢内侧,距腕关节约3 mm的尺桡骨缝间)、“足三里”(膝关节后外侧,在腓骨头下约5 mm处),定位参考《实验动物常用穴位名称与定位第2部分:大鼠》[10]。将大鼠穿好鼠衣后固定于鼠架上,暴露四肢,采用75%乙醇对穴位进行无菌操作后,手持一次性毫针(0.28 mm×25 mm)向下平刺“印堂”5 mm,直刺“内关”1 mm“足三里”7 mm。同侧“内关”“足三里”连接1组电极,1只大鼠共连接2组电极,启动华佗牌电针仪,选用连续波,频率2 Hz,电流强度1 mA,控制四肢的振动幅度,避免剧烈抖动。操作完成后,拔出毫针并用无菌纱布按压防止出血。模型组大鼠仅固定,不予电针。模型组和电针组每日干预1次,每次30 min,共干预14 d。

2.3 检测指标

2.3.1 大鼠一般状态 观察并记录各组大鼠实验过程中毛发情况、活动度、大便性状、进食量和体质量等变化情况。

2.3.2 大鼠胃排空率及小肠推进率 对大鼠进行末次电针干预结束后,进行禁食不禁水处理,于取材前称质量。按文献[11]的方法制备黑色半固体糊:用10 g羧甲基纤维素钠溶于250 mL蒸馏水中,依次添加8 g糖、8 g淀粉、16 g奶粉和2 g活性炭末,顺时针搅拌至无干粉状态。每只大鼠灌胃3 mL,30 min后用2%戊巴比妥钠(2 mL/kg)麻醉大鼠,麻药起效后,将大鼠四肢固定于自制鼠板上,开腹,暴露胃及小肠,先用线结扎胃贲门及幽门,沿结扎处剪断,取出全胃,用滤纸轻轻沾干血液后,放置于有干净滤纸的微量电子秤上测量全胃质量。找到胃大弯,沿边缘剪开胃体,置于装有0.9%氯化钠注射液的换药碗中,清除胃内残留物,洗净后用滤纸吸干水分,再次放置于微量电子秤上称质量,得到胃净质量,根据公式推算胃排空率。胃排空率=[1-(全胃质量-胃净质量)/灌胃量]×100%。称质量后剪取胃窦部组织,再次洗净后置于4%多聚甲醛中固定。剪取胃组织后,用镊子分离与其他组织相连的肠管,取完整小肠组织,平展于空实验台,用软尺测量幽门至黑色半固体糊最前端的长度,再次测量幽门和回盲部的总长度,并计算小肠推进率。小肠推进率=黑色半固体糊最前端长度/小肠总长度×100%。测量完毕后剪取多段十二指肠组织,沿肠壁一侧剪开十二指肠,并用生理盐水将十二指肠内容物清洗干净,置于-80 ℃冰箱保存待用。

2.3.3 HE染色法观察大鼠胃窦的组织形态 用4%多聚甲醛固定胃窦组织,随机抽取已固定的胃窦组织送检,每组5份,组织切片用苏木精染色3～5 min后,自来水洗净,用乙醇梯度脱水,加入伊红染液中染色5 min,脱水后用中性树胶封片,置于光学显微镜下,观察每只大鼠胃窦组织形态。

2.3.4 Western blot法检测大鼠十二指肠CRHR2、NLRP6蛋白表达水平 于每组中随机取5份十二指肠组织,添加RIPA裂解液裂解后,提取蛋白,使用BCA试剂盒检测蛋白浓度;调配10% SDS-PAGE凝胶,转膜处理后,添加脱脂牛奶,室温下封闭30 min;分别加入一抗CRHR2(1∶1 000)、NLRP6(1∶1 000),4 ℃恒温培养过夜,用TBST快速洗膜3次后,添加二抗(1∶5 000),室温培养30 min,添加混合好的ECL溶液曝光条带,采用Image J图像分析软件对目的条带灰度值进行分析。

2.3.5 阿利新蓝染色法观察大鼠十二指肠的组织形态 取冻存的十二指肠组织,石蜡包埋,超薄切片后,脱腊水洗,将切片浸泡于阿利新蓝A染液中10 min,水洗后,用阿利新蓝B染液浸染细胞核3 min,至细胞核清晰,脱水透明,树胶封片。使用CaseViewer 2.2(3DHISTECH有限公司)选取组织的目的区域进行成像。

3 结果

3.1 模型复制前后3组大鼠一般状态比较 模型复制前,3组大鼠均活泼好动,修饰行为较多,反应灵敏,粪便呈颗粒状,毛发有光泽,进食量多,体质量增长较快,且3组大鼠体质量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。模型复制14 d后,模型组和电针组大鼠喜扎堆,少动,常蜷卧于角落处,毛发发黄呈打结状,大便稀软或呈水糊样,有腥臭味,进食量减少,体质量下降,与空白组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。电针干预14 d后,电针组大鼠反应灵敏,动作迅速,活动及修饰行为增多,毛发整齐顺滑,大便干燥,无明显异味,进食量增加,体质量较模型组显著上升(P<0.05)。见图1。

注:与空白组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

3.2 3组大鼠胃窦的组织形态比较 光学显微镜下,空白组大鼠胃窦结构完整,细胞排列整齐,无异常增生。模型组大鼠胃窦基质的组织液增多,结缔组织排列疏松,黏膜下层轻度水肿,伴有少量淋巴细胞浸润。电针组大鼠胃窦固有层排列紧密,黏膜上皮完整,无明显细胞脱落,各层肌纤维着色一致,细胞分界明晰,无炎症细胞聚集。见图2。

注:A.空白组;B.模型组;C.电针组;标尺示50 μm

3.3 3组大鼠胃排空率及小肠推进率比较 与空白组比较,模型组大鼠胃排空率、小肠推进率显著降低(P<0.05)。与模型组比较,电针组大鼠胃排空率、小肠推进率显著升高(P<0.05)。见图3。

注:与空白组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;A.空白组;B.模型组;C.电针组

3.4 3组大鼠十二指肠组织中CRHR2、NLRP6蛋白表达水平比较 与空白组比较,模型组大鼠十二指肠组织中CRHR2、NLRP6蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。与模型组比较,电针组大鼠十二指肠组织中CRHR2、NLRP6蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见图4。

注:A.空白组;B.模型组;C.电针组;与空白组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

3.5 3组大鼠十二指肠组织形态比较 与空白组比较,模型组大鼠十二指肠绒毛上皮细胞间隙增宽,黏膜不连续,肠绒毛结构细长、破碎,隐窝深度增加,杯状细胞数减少。与模型组比较,电针组十二指肠绒毛上皮细胞间隙清晰、排列紧密、长短一致,组织结构粗壮、完整,隐窝深度下降,杯状细胞数丰富。见图5。

注:A.空白组;B.模型组;C.电针组;标尺示50 μm

4 讨论

FD的发病机制尚未探明,目前认为十二指肠的异常是其重要的致病因素,主要表现为十二指肠的敏感性增高、黏膜通透性增大,进而导致黏膜屏障功能受损以及黏膜的低级别炎症等[12]。十二指肠可归属于中医学“小肠”范畴。当小肠的泌别清浊功能失常时,胃中食糜下传受阻,小肠无法将水谷精微上输至脾,亦无法将糟粕下传至大肠,食糜滞留于胃肠,脾气难升,胃气难降,导致气机升降失常,临床可见腹部胀痛、嗳气、呃逆等不适,与FD症状相符。因此,本研究着眼于十二指肠功能,探讨电针对FD大鼠十二指肠CRHR2、NLRP6蛋白表达的影响,旨在为FD的治疗提供实验依据。

研究[13]显示,足三里、内关是治疗FD的常用穴位,两者合用可健脾理气、和胃降逆。研究[14-15]发现,针刺足三里可降低白细胞介素类炎症因子在肠组织中的表达水平,对肠道炎症具有明显调节作用;另一方面可加速胃肠黏膜DNA、RNA与蛋白质的合成,为胃肠道黏膜提供营养,加速胃肠道黏膜的修复。内关是手厥阴心包经的络穴,针刺内关可增加脑血管数,使侧支循环发挥代偿作用,改善大脑局部缺血状况,减轻神经元的损伤,可治疗神志疾病;同时,内关也是八脉交会穴,通于阴维脉,阴维脉与足三阴经相联系,均上行进入腹部,故针刺内关还可助脾化湿、理气解郁,促进胃腐熟,可用于治疗脾胃系统疾病[16]。肖梦丽等[17]采用关键词共现分析法统计发现,抑郁、焦虑量表是FD相关文献的高频关键词,说明FD与精神情志密切相关,抑郁、焦虑等负面情绪可加重FD患者胃肠不适症状。印堂穴属督脉,是治疗抑郁、焦虑的经典穴位[18],有调神解郁的功效。因此,本实验采用“标本配穴”法,选取固护后天之本(脾胃)的“本穴”足三里,结合调理心神的“标穴”内关、印堂,共同发挥调理心神、标本兼治、最终调理脾胃气机的作用。

肠道是人体最大的内分泌及免疫器官,对维持肠道稳态起着关键作用。其中,肠黏膜作为人体与外界环境接触面积最大的组织,不仅能有选择性地从外部摄取养分,还能抵御细菌及其代谢产物的入侵。完整的肠黏膜屏障是维持人体健康,避免组织损害和疾病的关键[19]。研究[20]表明,促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasing hormone,CRH)的激活是慢性应激诱导FD肠道通透性增强的重要因素,慢性应激触发下丘脑—垂体—肾上腺轴的激活并增加CRH分泌,随后,肠蛋白酶、组胺、5-羟色胺、炎症因子等递质表达增多,损害肠上皮细胞之间的细胞内紧密连接。CRHR2可调节慢性应激诱导肥大细胞脱颗粒,能够激活肠道干细胞,有助于维持肠道黏液的正常分泌,并参与肠道微环境的稳态[21]。李晓红等[22]采用单独饲养加慢性捆绑束缚应激法连续刺激大鼠3周,成功复制肝郁脾虚证大鼠模型,发现肝郁脾虚证模型大鼠胃组织CRHR2水平显著降低,大鼠出现胃部紧缩、胃排空延迟、胃敏感性升高等不适症状。此外,研究[23-25]发现,CRHR2参与调节小鼠结肠炎的黏膜修复,抑制血管生成及结肠癌细胞的生长,提示CRHR2对十二指肠炎症反应存在正向调节作用。在本实验中,模型组大鼠胃排空率、小肠推进率和CRHR2蛋白表达水平均明显下降,这与李晓红等[22]的研究结果一致,慢性应激可使FD大鼠胃肠运动减弱,肠黏膜功能受损。

NLRP6是NOD样受体家族成员之一,主要分布于肠上皮细胞以及分泌肠道黏液的杯状细胞中,可参与机体炎症免疫应答和肠道微生态的调控。研究[26]证实,慢性应激可激活脑—肠轴应激信号CRH,异常升高的CRH能够直接作用于肠上皮细胞并抑制NLRP6的表达,进而诱导肠道微生物群失常。此外,Bruce等[27]发现,NLRP6、CRHR2的表达水平与CRH存在负相关性,慢性应激可诱导FD,FD患者出现十二指肠杯状细胞数量和黏蛋白胞吐减少,提示FD肠黏膜免疫的失常,同时十二指肠组织中NLRP6、CRHR2蛋白表达水平降低,表明FD患者十二指肠中下丘脑—垂体—肾上腺轴信号传导失调可损害CRHR2的表达,使NLRP6自噬功能降低,导致肠道黏液分泌减少,从而增高肠道黏膜通透性,破坏肠上皮细胞的屏障功能。本实验发现,模型组大鼠大便不成形,胃窦黏膜下层轻度水肿,黏膜层排列疏松,有轻度炎症反应,十二指肠绒毛上皮细胞间隙增宽,肠绒毛变细、破碎,隐窝深度增加,杯状细胞数减少。肠绒毛与营养物质的吸收有关,隐窝则与黏液的分泌相关,隐窝的深度与肠上皮细胞的成熟率呈负相关[28]。电针“印堂”“内关”“足三里”可调整FD大鼠大便性状,改善胃窦炎症反应,恢复十二指肠绒毛上皮细胞正常间隙,降低隐窝深度,提升杯状细胞数,表明电针通过改善FD模型大鼠的一般状态,减轻胃肠炎症反应,提高十二指肠的吸收功能,增加肠上皮细胞成熟率及杯状细胞数,从而降低胃肠黏膜通透性,恢复肠道的机械屏障功能,其作用机制可能与上调FD大鼠十二指肠组织中CRHR2、NLRP6的表达水平有关。

综上所述,慢性应激可使FD大鼠出现精神欠佳、少动、毛发打结发黄、大便不成形等一般状态的异常,胃排空率、小肠推进率降低,出现胃窦组织的炎症反应,十二指肠组织的通透性增高,电针“印堂”“内关”“足三里”可增加FD大鼠十二指肠组织中CRHR2、NLRP6表达水平,进而改善FD模型大鼠一般状态,增强胃肠动力,减轻胃窦炎症细胞浸润,激活肠道免疫,下调肠黏膜的通透性,参与维持肠道屏障的完整性。然而,电针是否通过调控肠道紧密连接或其他调节通路发挥下调肠黏膜通透性的作用,还需要进一步研究。