ADC值在下腔静脉梗阻型布-加综合征肝脏氧化应激损伤中的应用初探

朱 楠，刘 亚，成德雷，袁支忠，郑 磊，刘 超，齐吴娟，袁 昊，陈 丽

1.安徽省蚌埠市中医医院影像科，安徽 蚌埠 233300；2.安徽省合肥市第三人民医院影像科，安徽 合肥 231000；3.中国科学技术大学附属第一医院/安徽省立医院介入放射科，安徽 合肥231000

布-加综合征（Budd-Chiari syndrome，BCS）是肝静脉流出道梗阻导致的一系列症候群［1-2］。肝静脉梗阻后改变细胞内外水分子弥散状态和微循环的灌注，进而影响DWI信号［3-4］。DWI是反映水分子布朗运动的MRI 功能成像技术，可检测水分子扩散信息［5］。DWI 已用于评估脂肪肝、乙肝后肝硬化等其他肝病［6］，但其在BCS 淤血性肝损伤中的应用报道较少，应用价值尚未形成共识。因此，本研究参考Cheng等［3］的方法建立BCS 动物模型，探讨ADC 值在BCS肝损伤模型中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究经安徽医科大学附属省立医院（安徽省立医院）伦理委员会批准，自动物实验中心购买体质量215～275 g 的健康雄性SD 大鼠135 只［许可证号：SCXK（苏）2005-0001］，随机分为对照组（15只）、模型组（60 只）和假手术组（60 只），模型组及假手术组又各分为4个亚组（1、4、8、12周组，每亚组15只）。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 在12 h 明暗交替光照周期、温度15～25 ℃、湿度50%～60%条件下清洁饲养，丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒均购自上海信裕生物科技有限公司，3 F 微导管购自日本泰尔茂公司。模型组于剑突下正中开腹分离肝镰状韧带，暴露肝后段下腔静脉，平行紧贴下腔静脉以3 F微导管，以0 号线环绕结扎后抽出（图1）。假手术组未结扎肝后段下腔静脉，其他过程同模型组。对照组仅常规饲养。

图1 模型组结扎下腔静脉图 注：开腹暴露肝后段下腔静脉，平行紧贴下腔静脉以3 F微导管，并以0号线环绕结扎

1.2.2 MRI 及DSA 检查 对照组于第12 周末，模型组及假手术组亚组分别于实验后1、4、8、12 周末晨起停饲。MRI 检查前以3.6%水合氯醛腹腔麻醉，剂量1.0 mL/100 g 体质量。大鼠取仰卧位，腹部加压固定，将肝脏置于腕关节线圈中心。使用GE HDXT 1.5 T MRI 常规行T1WI、T2WI 序列及DWI 检查。DWI 序列的b 值取800 s/mm2，SE-EPI 序列加脂肪抑制（SPAIR），扫描参数：TR 1 250 ms，TE 65 ms，视野56 mm×56 mm，层距0.3 mm，层厚3.0 mm，翻转角90°，矩阵192×192，激励次数8。图像后处理：测量ADC 值，ROI 大小15～20 mm2，尽量避开肝脏边缘及胆管、血管，取3 个ROI 的平均值行进一步分析。使用GE Innova 3100-IQ DSA 行DSA 检查，各组大鼠于任意一侧下肢消毒、铺洞巾，以21 G 静脉留置针穿刺股静脉，注射对比剂观察下腔静脉血流情况。

1.2.3 标本采集及检测 分别于实验后1、4、8、12周末，取大鼠肝组织标本，制作组织切片行HE 染色，余标本制备肝组织匀浆，采用双抗体夹心法［3］检测MDA、SOD 的表达量，严格参照试剂盒说明书相应步骤操作。

1.2.4 标本采集及病理染色 取适量MRI 测量ROI相应层面的新鲜肝组织，10%福尔马林固定24 h后，石蜡包埋，制作肝脏病理组织切片，用HE 染色，观察肝脏病理染色情况，余标本均置于-80 ℃冰箱冷藏备用。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计软件，检验数据是否符合正态分布及方差齐性，正态数据以表示，ADC 值、MDA、SOD 在对照组与模型组及假手术组间的差异行单因素方差分析，模型组与假手术组间的差异行两因素方差分析，各亚组间多重比较行LSD 检验；以Pearson 法分析ADC 值、MDA、SOD 间的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成模情况

对照组存活15 只，假手术组1、4、8、12 周亚组分别存活14、14、15、15 只，对照组及假手术组活动如常、反应机警，DSA 均无阳性表现。模型组各亚组均存活14、13、13、13 只，存活大鼠均成模，大鼠术后毛色灰暗无光泽，活动逐渐减少、反应迟钝，肝后段下腔静脉管腔变窄，远端扩张，4 周后见侧支循环逐渐形成（图2）。

图2 模型组4周DSA 图 注：肝后段下腔静脉管腔变窄（黄箭），远端扩张，见侧支循环形成（红箭）

2.2 MRI表现

对照组、假手术组及模型组大鼠12 周常规T1WI未见明显异常，肝脏表面光滑，实质信号均匀，肝叶比例协调（图3～5）；各组随机抽取9 只，纳入数据分析。各组大鼠ADC 值比较见表1，图6～8。对照组与假手术组各亚组ADC 值比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）；模型组各亚组ADC 值均低于对照组及假手术组各亚组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。两两比较，模型组4周亚组及8周亚组均低于对照组及同一时间点的假手术亚组。模型组内ADC值随下腔静脉结扎时间延长呈先下降后升高趋势，1 周亚组高于4、8周亚组，4周亚组低于12周亚组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），ADC 值在4 周亚组最低（表1）。

表1 各组大鼠ADC值比较（×10-3 mm2/s，）

表1 各组大鼠ADC值比较（×10-3 mm2/s，）

注：与模型组1 周亚组比较，aP＜0.05；与模型组4 周亚组比较，bP＜0.05；与模型组8 周亚组比较，cP＜0.05；对照组、假手术组各亚组方差分析，F=0.203，P=0.935；对照组、模型组各亚组方差分析，F=13.053，P=0.001；模型组、假手术组各亚组方差分析，F=12.999，P=0.001。

图3～5 对照组、假手术组和模型组大鼠12 周肝脏T1WI 冠状位图 注：肝脏表面光滑，肝叶比例协调，实质信号均匀 图6～8 对照组、假手术组和模型组12周肝脏ADC伪彩图

2.3 MDA、SOD结果（表2，3）

表2 各组大鼠MDA比较（nmol/L，）

注：MDA 为丙二醛。与模型组1 周亚组比较，aP＜0.05；与模型组4 周亚组比较，bP＜0.05；与模型组8 周亚组比较，cP＜0.05；对照组、假手术组各亚组方差分析，F=0.337，P=0.851；对照组、模型组各亚组方差分析，F=50.937，P=0.001；模型组、假手术组各亚组方差分析，F=148.262，P=0.001。

表3 各组大鼠SOD比较（nmol/L，）

表3 各组大鼠SOD比较（nmol/L，）

注：SOD为超氧化物歧化酶。与模型组1周亚组比较，aP＜0.05；与模型组4周亚组比较，bP＜0.05；与模型组8周亚组比较，cP＜0.05；对照组、假手术组各亚组方差分析，F=0.102，P=0.903；对照组、模型组各亚组方差分析，F=28.368，P=0.001；模型组、假手术组各亚组方差分析，F=29.683，P=0.001。

对照组与假手术组各亚组间的MDA、SOD 水平比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。模型组各亚组MDA 均高于对照组及假手术组各亚组，模型组各亚组SOD 均低于对照组及假手术组各亚组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；两两比较，同一时间的模型组亚组与假手术组亚组MDA、SOD 值比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

模型组MDA 先升高后下降（第4 周最高），SOD先下降后升高（第4周最低），在模型组内各亚组比较，差异均有统计学意义；两两比较，模型组MDA、SOD在各亚组间多重比较，除了1 周亚组与12 周亚组、4 周亚组与8 周亚组间差异均无统计学意义之外，其余各亚组间多重比较均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.4 病理结果

假手术组及对照组观察至第12 周，肝细胞规律排列，形态正常，核仁清晰，肝血窦无扩张（图9，10）。模型组肝脏病理损伤随病程进展而加重，肝血窦扩张，小叶中心性肝细胞萎缩、变性、坏死，胞浆红染，红细胞淤积，以12周亚组最明显（图11～14）。

图9 对照组12 周大鼠病理图（HE 染色，高倍放大）图10 假手术组12 周大鼠病理图（HE 染色，高倍放大）图11～14 模型组大鼠1、4、8、12周病理图（HE染色，高倍放大）

2.5 各指标相关性分析

模型组ADC 值与SOD 呈正相关（r=0.828，P=0.001），与MDA呈负相关（r=-0.756，P=0.001），SOD与MDA呈负相关（r=-0.834，P=0.001）（图15～17，表4）。

图15 MDA 与SOD 相关性散点图 注：模型组ADC 值与SOD 呈正相关（r=0.828，P=0.001）。MDA 为丙二醛，SOD 为超氧化物歧化酶 图16 MDA与ADC值相关性散点图 注：模型组ADC值与MDA呈负相关（r=-0.756，P=0.001）图17 SOD与ADC值相关性散点图 注：模型组SOD与MDA呈负相关（r=-0.834，P=0.001）

3 讨论

ADC 值是DWI 的量化参数，其可活体检测水分子运动［5-6］。Shin 等［7］研究发现，肝脏损伤会导致细胞外基质沉积，进而影响肝脏ADC值，肝脏ADC值与肝损伤严重程度呈负相关。BCS 的病理改变表现为肝静脉回流受阻，导致肝内微循环障碍，肝窦红细胞淤积；随着肝细胞水肿加重，肝细胞坏死，核破裂，进而影响水分子弥散［4］。BCS的本质是淤血性肝损伤，肝淤血后的缺氧状态可导致氧化应激损伤［3，8］。细胞的氧化损伤与能够引发胞膜脂质过氧化的自由基的产生有关。脂质过氧化的醛类产物MDA可能介导肝脏的慢性氧化应激损伤。MDA 在肝纤维化过程中增加了星状细胞中的Ⅰ型前胶原信使RNA 和蛋白质的表达［9-10］；SOD 是机体抗氧化系统的代表物，其可清除氧自由基［10］。

本研究发现，模型组MDA呈先上升后下降趋势，SOD 呈先下降后升高趋势，ADC 值始终低于正常水平，说明BCS 肝细胞存在水分子弥散受限和淤血后氧化应激损伤。研究发现，随着肝损伤加重，细胞外基质不断增加，水分子弥散受限，ADC 值逐渐降低，与肝损伤的发展呈负相关［11］。BSC模型损伤的机制可能是肝淤血缺氧后发生氧化应激损伤，改变细胞膜的通透性，阻碍细胞内水分子扩散，同时肝脏病理损伤随大鼠模型的观察时间推移不断进展，第12 周时淤血病理损伤最严重，这说明氧化应激介导了BCS淤血性肝损伤［12-15］。

本研究中模型组ADC 值与SOD 呈正相关，与MDA 呈负相关，这是因为肝静脉回流受阻，导致肝窦淤血，肝细胞内水分子扩散受限，淤血缺氧后诱导缺氧因子表达，导致氧化应激损伤［4］；这与内镜下观察到的肝索破坏、汇管区红细胞聚集、肝脏淤血一致，提示DWI 可一定程度反映肝淤血缺氧损伤程度［4］。4 周后，随着侧支循环建立，MDA 逐渐下降（SOD 及ADC 值逐渐上升），这说明随着4 周后侧支血管的建立，代偿了肝脏的静脉回流障碍，从而改善了肝脏的微循环障碍，提高了肝细胞水分子扩散能力。然而，模型组ADC 值始终低于对照组健康大鼠，说明BCS 的肝脏损伤随着自然病程会持续进展，无法自愈，与其他学者的研究［16-17］相符。

综上所述，ADC 值与BCS 的肝脏淤血缺氧后的氧化应激损伤存在一定的相关性，可作为动态评估BCS肝脏淤血缺氧损伤的新的检查手段。