剪切波弹性成像技术对低强度脉冲超声刺激足三里穴引起肌张力变化的评估

韩 镍，单佳丽，陆玲玲，汪倩妮，金 琳

1.上海中医药大学附属光华医院超声科，上海 200052；2.上海体育大学运动健康学院，上海 200438；3.上海健康医学院附属嘉定区中心医院超声科，上海201800

低强度脉冲超声（low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS）作为一种治疗性的超声波，已逐渐应用于中枢及外周神经的调节［1］。根据传统的针灸理论，“得气”作为针灸的关键部分，既是针刺效果的前提，也是治疗的关键因素，“得气”的快慢与治疗效果密切相关［2-3］。当“气”到达时，患者常感到酸、麻、胀、重，而针灸医师则常感到手部沉重、紧绷或停滞，局部组织表现为肌张力增加。超声剪切波弹性成像技术（shear wave elastography，SWE）通过测量剪切波的传播速度可反映组织的硬度，在针刺研究中可实时动态观察、定量分析穴位局部组织结构的变化，在穴位精准定位、得气等的研究中均有重要价值［4-5］。

本研究通过SWE 评估LIPUS 刺激足三里穴时肌张力的变化情况，以期为LIPUS 实现经穴效应的研究提供更多信息。

1 资料与方法

1.1 一般资料

实验动物为16 只雄性SD 大鼠（体质量200～250 g），购自上海睿太莫斯生物科技有限公司，均按照相关准则进行管理（实验动物伦理批准文号：20221130）。大鼠饲养环境：12 h明暗交替，温度（22±2）℃，空气相对湿度（50±10）%。SD 大鼠随机分为胫骨前肌组和腓肠肌组各8只。

1.2 仪器与方法

使用LIPUS 换能器（TP1.1C4NF，多普勒），射频功率放大器（HSA4102，NF）和功能发生器（WF1974，NF）和超声诊断仪（Aplio i800，东芝），18 MHz 线阵探头。应用LIPUS 连续刺激大鼠足三里穴，通过SWE 监测胫骨前肌及腓肠肌的肌张力变化。参照《实验针灸学》及相关文献定位实验动物穴位［6-7］，足三里穴定位于后肢膝关节后外侧腓骨头下约3 mm处。采用1%戊巴比妥钠以剂量50 mg/kg 体质量对大鼠进行腹腔注射麻醉。以痛觉反射、翻正反射和眼睑反射消失作为进入麻醉期的指标，以动物眼睑反射恢复为苏醒的指标［6］。剔除局部毛发涂抹耦合剂。采用直径为4 mm的LIPUS换能器连续刺激穴位20 min。单位面积功率0.88 W/cm2，频率1.1 MHz，占空比27%。

大鼠进入麻醉期后，下肢取自然位（踝关节屈曲约90°），厚涂耦合剂，探头轻放在足三里穴区，避免下肢肌肉受压。根据足三里穴局部肌肉解剖，超声探头长轴与大鼠腓肠肌肌束方向平行的状态下，开启剪切波弹性模式。在腓肠肌定位基础上，探头向小腿前外侧平移，即可定位胫骨前肌。选取肌腹中段较厚部位为弹性成像ROI，ROI 直径2 mm，深度0.5～1.0 cm［8］（图1）。连续观察在LIPUS刺激后20 min内穴位周围肌肉弹性值，每隔30 s测量1次组织弹性图，测量3次取平均值。

图1 剪切波弹性技术测量肌紧张度 注：图1a 为测量胫骨前肌剪切波速度，图1b为测量胫骨前肌杨氏模量值，图1c为测量腓肠肌剪切波速度，图1d为测量腓肠肌杨氏模量值；ROI直径为2 mm，测量深度为0.5～1.0 cm

1.3 重复性检验

选取16 只大鼠的SWE 动态图像，由2 位医师分别测量剪切波速度和杨氏模量值；再由其中1位医师重复测量，并将结果用于重复性检验。

1.4 血清5-羟色胺（5-Hydroxytryptamine，5-HT）浓度检测

使用5-HT ELISA 试剂盒（xl-Er0425，新乐生物技术有限公司），LIPUS 干预前后分别通过颈静脉采集约1 mL 血液于促凝管中，在室温下凝固1 h，3 000转离心15 min，并储存在-20 ℃。血清5-HT浓度通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）进行量化。

1.5 统计学分析

采用SPSS 28.0和GraphPad Prism 9.0软件进行数据分析。计量资料以表示。2组数据比较行t检验；多组数据比较行ANOVA 分析，事后检验采用Dunn’s 检验；采用Bland-Altman 法分析和组内相关系数（intraclass correlation coefficient，ICC）评价观察者间和观察者内的重复性。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 超声检查

胫骨前肌及腓肠肌的剪切波速度、杨氏模量值及其平均值曲线图见表1、2及图2。

表1 胫骨前肌肌张力变化（）

表1 胫骨前肌肌张力变化（）

注：事后检验以基线水平为对照组，采用Dunn’s检验法。

表2 腓肠肌肌张力变化（）

表2 腓肠肌肌张力变化（）

注：事后检验以基线水平为对照组，采用Dunn’s检验法。

图2 低强度脉冲超声（LIPUS）刺激足三里穴后的穴位周围组织肌张力变化 注：图2a为胫骨前肌及腓肠肌杨氏模量值变化，图2b为胫骨前肌及腓肠肌剪切波速度变化

相较于基线水平（0 min），胫骨前肌的肌张力在刺激足三里穴后3 min，剪切波速度和杨氏模量值均显著增高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。相较于基线水平，腓肠肌刺激后13、14 min 剪切波速度和杨氏模量值均显著升高，差异均有统计学意义（均P＜0.001）。

2.2 重复性检验

同一医师检测杨氏模量值和剪切波速度的ICC分别为0.55、0.67，表明一致性均良好（图3a，3b）。Bland-Altman 散点图分析显示，不同医师杨氏模量值2 次测量差值为（-0.02±1.03）（图3c），剪切波速度值平均差值为（-0.01±1.08）m/s（图3d），且所有点均位于相应的95%一致性界限内。

2.3 5-HT浓度变化

LIPUS刺激足三里穴20 min后，血清5-HT水平较刺激前明显增加［（27.92±7.72）×10-3μmol/L vs.（35.44±7.76）×10-3μmol/L］（P＜0.05）（图4）。

图4 血清5-羟色胺水平变化 注：LIPUS为低强度脉冲超声

3 讨论

LIPUS 是指有效强度＜3 W/cm2的脉冲型超声波，自2010 年Tufail 等［9］使用LIPUS 刺激在体小鼠海马，成功诱发了CA1 区gamma 振荡和尖波-涟漪振荡，实现了LIPUS 调控中枢神经的可行性。近年来，LIPUS作为一种无创调控手段得到了快速发展，在中枢、外周神经调控、疾病治疗等方面发挥重大作用［10-11］。针灸的治疗效应源于经络理论，特定的经络、腧穴与人体有着特殊联系，可产生一定的治疗作用，而“得气”是针刺取效的法门，“得气”感即针感，与针刺效应密切相关。本研究应用SWE 实时观测LIPUS 刺激足三里穴后肌张力的变化，探索LIPUS 在经穴特异性研究中的可行性。

本研究显示，在LIPUS 刺激后，胫骨前肌及腓肠肌的剪切波速度和杨氏模量值均先升高、后下降趋于稳定；说明LIPUS 刺激穴位后局部肌肉组织硬度发生改变。这主要是因为超声波可能通过空化效应作用于穴位处的局部肌肉筋膜和神经，局部筋膜区域细小神经放电，选择性地激活机械敏感的Na+和K+通道，从而引起肌肉收缩、带来组织硬度的变化［12］。经络效应是一个复杂的综合效应，一方面穴位局部筋膜的刺激产生肌肉痉挛及硬度变化，可能还伴随穴位局部特异性的神经纤维发生改变，这些变化共同组成了针刺效应［13］。然而在以往的针刺效应研究中，传统针灸针刺穴位后可立即观察到局部肌张力的增加［14］。而LIPUS 引起的肌肉硬度升高的峰值时间相对延迟，可能与超声能量的衰减和沉积有关。当能量通过介质时，超声波除了衰减外，还在介质中沉积动量，产生声辐射力［15］。考虑到穴位的深度，超声能量需积累到一定程度才能引起穴位周围神经的放电。因此，本实验中，腓肠肌的肌张力升高峰值时间晚于胫骨前肌，可能因为腓肠肌位置较深，其组织质地较硬，在LIPUS 刺激时需沉积更多能量而产生硬度的变化。另外，胫骨前肌及腓肠肌的剪切波速度和杨氏模量值在升高后下降趋于稳定。考虑随感受器的适应现象，肌张力逐渐降低，即使刺激仍有效，但传入神经纤维的冲动频率已开始下降［16］。这一现象与Leow等［17］的报道一致。

电针足三里穴能有效调节正常大鼠血清及组织中5-HT 的变化［18］。本研究显示，LIPUS 刺激足三里穴后，大鼠血清中的5-HT浓度升高，与以往研究［19-20］结果一致，提示LIPUS 刺激足三里穴与神经活动调节有相关性。

本研究的局限性：仅以大鼠为实验对象，实验参数是基于前期LIPUS 和电针的神经调节研究；5-HT浓度升高，但仍在正常范围内，主要因实验对象为正常大鼠，今后将纳入不同疾病进一步研究。

综上所述，SWE 可为评估LIPUS 刺激穴位引起的肌肉张力变化提供客观依据，为LIPUS 的经穴效应研究提供更丰富的信息。