酶催化固碳过程及其强化技术研究进展

王玉杰，张艳梅，栾金义，赵之平

（1 中石化（北京）化工研究院有限公司，北京 100013；2 北京理工大学化学与化工学院，北京 102488）

工业的快速发展和化石燃料的大量使用，导致CO2等温室气体的大量排放，引发诸多环境问题[1-2]。为此，开发高效、经济的CO2捕集、利用及储存（CCUS）技术减少CO2排放，实现CO2资源化利用非常重要[3-4]。在低碳排放的背景下，人们已提出了多种固定CO2（简称固碳）的策略，将CO2从大气中捕获并储存或将其转化为其他化合物，包括：物理固碳（吸附、冷凝）、化学固碳（化学吸附、矿物碳化）和生物固碳[5]。其中，使用化学或物理化学技术均存在成本高、效率低、能耗大、工艺复杂、环境污染等问题[6]。

天然生物固碳是生物质（如草木、微藻等）吸收自然环境中CO2或微生物利用CO2、CO和有机碳等为底物，通过酶催化转化成有机物的过程。目前已发现的六种天然生物固碳途径有：卡尔文循环、还原性三羧酸循环、还原性乙酰辅酶A途径（W-L循环）、3-羟基丙酸/4-羟基丁酸途径、3-羟基丙酸途径、二羧酸/4-羟基丁酸途径[7-8]。然而，天然生物固碳途径，其核心氧化还原酶等存在催化速度慢、催化反应复杂、严格厌氧等诸多问题。因此，构建人工生物酶催化系统并对其进行优化，为酶催化固碳提供了新的机遇。相较于天然生物固碳，可以在生物体外人工构建生物固碳体系，利用生物催化剂酶，将工业过程中产生的CO2转化为有机化合物及高价值生物基产品，该体系可以通过优化生物酶催化剂构建、反应器设计以及操作参数等，来提高酶的活性、贮存稳定性、固碳反应速率和效率，节能降耗，从而降低成本，实现过程强化。Tong等[9]报道了一种将CO2和乙醇通过相对简单的多酶级联催化途径转化为L-乳酸，在间歇式反应体系中可将41%乙醇转化为L-乳酸，为生物可降解聚合物的合成提供新的、可持续的替代方法。天津大学姜忠义团队[10]采用海藻酸盐-二氧化硅复合材料将三种脱氢酶封装固定，与游离酶相比，酶的活性、贮存稳定性和重复利用率显著提高，CH3OH产率可达98.1%，贮存60 天及重复使用10 次以上均可保留超过76%的甲醇产率。在全球变暖和气候变化日益严重的情况下，酶催化固碳被认为是一种可持续发展的解决方案，对生物体外酶催化固碳过程及强化技术研究具有重要意义。

本文介绍了用于酶催化固碳的关键酶类型及其优化。阐述了CO2资源化利用具体方式，包括催化CO2转化为甲酸（HCOOH）、甲醇（CH3OH）、甲烷（CH4）、淀粉、L-乳酸、丙酮酸等。重点阐述了辅因子的原位再生、酶的固定化、反应系统的优化设计、反应条件优化（pH、温度、底物浓度）以及产物原位分离等酶催化CO2反应过程的强化技术。最后，总结了酶催化固碳过程及强化技术研究存在的问题，并对其未来发展进行了展望。

1 催化CO2转化酶及其优化

1.1 酶的分类

酶作为生物催化的关键，因其在高产率条件下执行复杂反应以生产所需的化合物而备受关注[11]。可将利用CO2作为底物的六种不同酶区分为两类：①氧化还原酶[如甲酸脱氢酶（FDH）、一氧化碳脱氢酶（CODH）、重塑固氮酶等]和②裂解酶[碳酸酐酶（CA）、丙酮酸羧化激酶等][5,12-13]。通过使用自然界的不同酶进行CO2的体外催化转化以合成化合物/燃料的情况列于表1中。

表1 不同酶催化CO2转化

从理论上讲，氧化还原酶是催化电子从一个分子（还原剂或电子供体）转移到另一个分子（氧化剂或电子受体）的酶。在氧化还原反应中，使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）等辅因子。氧化还原酶转化CO2的目的是通过降低碳元素的氧化状态来获得碳基能源[14-15]。

1.2 酶的筛选和优化

尽管目前已经有大量的酶用于CO2催化转化领域，但仍不能有效满足环境应用与工业化生产中的迫切需求。在工业化生产中，酶需要在溶剂中发挥催化作用，酶的稳定性往往会受到很大影响，这一工业需求随之带来一个问题：能否利用蛋白质工程技术提升酶在溶剂中的稳定性，从而保证甚至提高其催化活性？

因此，为了充分发挥酶在CO2催化转化中的作用，首要任务是对酶进行筛选与优化，选择适合的酶催化剂，深入研究酶的优化策略，通过基因工程、蛋白质工程等方法对酶进行改造，提高酶的催化活性、稳定性和特异性，增强与CO2的结合能力。基于此，在20 世纪90年代早期，美国加州理工学院Frances H.Arnold 教授开创了“定向进化”方法，即通过一定程度上模拟自然进化与选择的过程，实现对蛋白质引入有益突变，从而改造蛋白质功能，并因其在“酶定向进化”上所作出的杰出贡献被授予2018 年诺贝尔化学奖。受此启发，为了缓解恶劣工艺条件对碳酸酐酶（CA）活性的抑制，Oscar 等[28]利用定向进化结合蛋白质序列活性关系（ProSAR）算法，通过10轮的突变与筛选，创制了一种高度稳定的CA 变体，这种CA 变体在pH>10的4.2mol/L 碱性胺溶剂中，耐受温度高达107℃。相较于天然酶，该CA 变体的耐热性和耐碱性显著提高。Fisher 等[29]也利用蛋白质工程技术改性人碳酸酐酶（human carbonic anhydrase Ⅱ，HCAⅡ）中远离活性位点的表面氨基酸残基，存在于表面的部分氨基酸残基（Tyr7、Leu224、Leu100、Leu240、Asn67 和Asn62）分别被苯丙氨酸（Phe）、丝氨酸（Ser）、组氨酸（His）、脯氨酸（Pro）、谷氨酰胺（Gln）和亮氨酸（Leu）取代，使疏水性氨基酸突变成亲水性氨基酸，热稳定性提高6℃。此外，FDH是各种CO2还原制甲酸系统中最好的生物催化剂之一，为了进一步提高FDH 的热稳定性，Rojkova 等[30]采用了一种基于蛋白质α-螺旋疏水化的通用方法，对不同来源的9个FDH氨基酸序列进行比较研究，并结合来源于甲基营养细菌假单胞菌sp.101酶的三元结构分析，筛选出5个位点为131、160、168、184 和228 的 丝 氨 酸 残 基（serine residues）进行诱变，Ser131 和Ser160 的残基被替换为丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）和Leu，Ser168、Ser184 和Ser228 的残基被改变为Ala，只有在131、160、184 和228 位置的Ser/Ala 突变导致了FDH 稳定性的增加。根据被取代残基的位置，在131、160、184和228位置分别使用Ala取代Ser后得到的四种单点突变体（Ser131Ala、Ser160Ala、Ser184 Ala、Ser228Ala）可使FDH 稳定性提高5%～24%，而在131、160、184 和228 位置同时使用Ala 取代Ser 后得到的四点突变体（Ser131Ala/Ser160Ala/Ser184Ala/Ser228Ala）可使FDH的热稳定性较野生型FDH提高1.5倍。

2 CO2的酶催化转化

随着生物催化领域的迅速发展，对于酶类催化系统的深入研究已经揭示出许多令人振奋的发现。酶作为高度选择性和高效催化活性的生物催化剂，具有特定的催化基团和催化机制，其多样性在催化转化过程中充分展现。在了解酶的分类及其优化的基础上，探讨催化生物酶在CO2转化领域中的应用。

2.1 碳酸酐酶催化CO2水合

CA 也被称为碳酸盐脱水酶或碳酸盐裂合酶，其活性中心通常含有锌离子（Zn2+），通过协助底物的吸附、促进水的裂解等催化水合CO2与水相互转化[31-33]。根据结构和功能的不同，碳酸酐酶主要划分为α、β、γ、δ四大类，其中的α-CA和β-CA是最为广泛研究的两类，存在于细菌、植物、动物等生物体中。

在自然状态下，CO2的可逆水合反应十分缓慢，然而在CA 催化下，CO2水合反应速率常数显著提高，这说明借助CA 能有效提高CO2的水合反应速率。催化机理为两个关键步骤：第一步是CA中与活性中心Zn2+相连的H2O去质子化形成中间产物EZnOH-，随后CO2与EZnOH-中的OH-水合形成EZnHCO-3，然后EZnHCO-3中的HCO-3被水置换形成EZnH2O 和HCO-3[式(1)]；第二步是EZnH2O 的去质子化，EZnH2O 通过酶分子中的质子转运体将质子（H+）转运至溶剂中并被还原成具有催化活性的EZnOH-，在催化过程中主要是通过酶分子活性区域64号组氨酸（His64）实现H+向溶剂转运[式(2)，其中B表示质子受体]。

2001 年，受HCA Ⅱ快速水合作用的启发，Bond 等[34]首次报道了牛碳酸酐酶（bovine carbonic anhydrase Ⅱ，BCAⅡ）对CO2的捕获和转化效果。为接下来几十年内研究人员从生物体内提取CA 并捕获CO2提供了重大机遇。Supuran 等[35]研究指出CA 活性中心的Zn2+通过与CO2的Lewis 酸-碱反应，与CO2形成稳定配合物实现高效吸附。这一步骤被认为是整个催化反应的起始点，随后活性中心中的Zn2+发挥催化作用，降低H2O分子裂解的活化能[36]，促使H2O 分子发生裂解，产生H+、OH-。基于此，Silverman 等[37]进行了大量的动力学研究，建立了CA 催化CO2水合反应的机理模型，揭示了其催化机制的关键步骤。结果表明，CA 催化CO2水合反应中基本且关键步骤是H2O的水解作用[38]。

2.2 CO2转化为甲醇

CH3OH 作为一种重要的化学品，具有广泛的用途和经济价值[20]。不仅是清洁燃料的关键组成部分，也是合成许多有机化合物的基础原料，酶催化CO2还原策略为甲醇的可持续生产提供了有效的解决方案[39-40]。

为了提升CH3OH 的转化效率，近年来多酶级联催化CO2转化为甲醇受到了广泛关注。其中，在辅因子NADH 的作用下，FDH、甲醛脱氢酶（FaldDH）以及乙醇脱氢酶（ADH）共同参与催化CO2生成CH3OH的反应模式成为备受瞩目的研究前沿之一。相对于以单一酶为基础的燃料（如CO、CH4等）生产方法，采用多酶法生产液态CH3OH具备更高的能量容量，并且便于储运[41-42]。Yoneyama等[43]首次以FDH 和甲醇脱氢酶（MDH）为催化剂，吡咯喹啉醌（PQQ）为辅因子，成功地将CO2电化学还原为甲醇。如Yoneyama 的报告所述辅因子的类型极大地影响了CO2的还原行为，适当的辅因子可以提高多酶反应的速率。为了利用脱氢酶在辅因子存在下有效催化CO2还原这一事实，Wang等[44]验证了该多酶级联反应体系的热力学可行性；孟令玎等[15]将三种脱氢酶共同封装在多孔硅胶溶胶-凝胶基质中，发现与游离酶相比，甲醇产率/产量显著提高，这归因于多酶在硅胶纳米孔内的限域封装提高了其催化活性，有利于反应的热力学平衡。

2.3 甲酸脱氢酶催化CO2产甲酸

FDH 催化CO2转化的首选产物应为HCOOH 或CO[式(3)、式(4)]，其中，HCOOH 可用于CH3OH 生产、H2生产、直接HCOOH燃料电池等领域，是一种重要的化学品。FDH 通常可分为两种类型：①金属依赖型FDH，其活性部位含有钼（Mo）或钨（W）的金属依赖酶，Mo 或W 原子构成氧化还原活性中心；②非金属依赖型FDH，其依赖于辅因子NADH（NADPH）进行CO2还原[45]，大量案例表明[29]，在温和的反应条件下，以NADH为电子供体，FDH 可催化CO2反应生成HCOO-[46-49]。同时，FDH 也可催化CO2甲酸化逆反应，将HCOOH 氧化为CO2，伴随着NAD＋还原为NADH，因此控制逆反应的发生对FDH催化CO2甲酸化十分重要。

以往的研究表明，在酶促CO2还原HCOO-的过程中，FDH 所需的NADH 量较大，为规避NADH的高成本和获取困难造成的限制，研究人员提出多种解决方案。包括电/光驱动的NADH 再生，旨在降低成本并改善甲酸盐的产量。例如，将NADH直接分散在带有中性红（neutral red，NR）修饰电极的阴极室中，通过酶电催化实现CO2还原成HCOO-[48]。此外，通过合成金属有机框架（MOF）封装FDH 酶，可以利用可见光或紫外光照射来驱动NADH的再生以及CO2的减排。2023年，加拿大滑铁卢大学陈忠伟与河南师范大学杨林团队[3]通过利用生物电催化技术在体外环境下促进生物酶的活性，将FDH 原位封装在以Zn为配位金属、2-甲基咪唑为配体制备得到的沸石咪唑骨架结构材料（ZIF-8）中，该框架充当辅酶并增强酶的混合协同催化作用。研究表明，合成的FDH@ZIF-8 纳米笼结构杂化（CSH）催化剂表现出改进的酶催化能力，CSH 催化剂使CO2转化为HCOOH 的速率比纯FDH催化剂高28倍。

2.4 固氮酶还原CO2制备甲烷

CH4是清洁能源和化工工业的重要原料之一，通过固氮酶（nitrogenase）将CO2转化为CH4，对实现低碳经济和促进化工领域的发展至关重要[7,50]。固氮酶是介导生物固氮过程的一类特殊酶，根据其活性中心和催化机制的不同，主要被分为铁-钼氮酶（FeMo固氮酶）和铁-铁氮酶（FeFe固氮酶）[30]。固氮酶催化中心位于固氮酶的FeMo 辅因子，在三磷酸腺苷（ATP）参与下，经多次电子/质子转移反应，催化N2生成两分子NH3[式(5)]。

近年来，Zheng 等[51-52]首次研究发现了沼泽红假单胞菌内的纯铁固氮酶不仅可以固定N2为NH3，也可以固定CO2产CH4。这为探索CO2甲烷化新方法提供了思路。随后，Yang等[53]发现钼铁固氮酶虽然不能还原CO2，但是，当钼铁固氮酶活性中心附近的两个关键氨基酸被替换后，可催化CO2发生八电子或双电子转移，以低速率催化还原为CO 或CH4[式(6)、式(7)]，为利用固氮酶人工转化CO2提供新的思路[54]。与此同时，生物电化学电-气（powerto-gas，P2G）系统利用生物电化学P2G 技术，通过微生物酶催化将CO2转化为CH4，对环境清洁友好，引起广泛关注。P2G 系统包括两个阶段过程[式(8)]：①通过水电解产生氢气；②将CO2在生物体内转化为CH4[55-56]。

2019 年，福建农林大学Zhou 等[57]首次证明了CO2还原为CH4可以通过产甲烷菌-半导体生物杂化体来完成。巴氏甲烷八叠球菌（Methanosarcina barkeri）被选为高效代谢CO2转化为CH4的产甲烷菌。将硫化镉（CdS）纳米颗粒与M.barkeri混合作为捕光聚合物，构建了M.barkeri-CdS生物杂化体。作为光敏剂的CdS具有高吸收系数的量子点，其表面静电作用可以支持与产甲烷菌的连接以减少电荷转移障碍。该杂化体的CH4产生速率为0.19μmol/h、量子效率为0.34%。该研究结果对通过探索新型纳米光导体与微生物之间的相互作用来开发用于CO2转化的半人工光合作用具有重要意义。美国加州大学Yang等[26]利用CdS纳米颗粒、金纳米团簇、高表面积硅纳米线阵列、MOF 等，实现了非光合作用细菌利用W-L途径将CO2还原为乙酸的反应，并使用甲烷菌作为固定CO2的生物催化剂，通过光电催化方法，实现CO2到CH4的转化。

2.5 CO2到淀粉的人工合成

淀粉作为一种关键的多糖类化合物，在生活和经济中扮演着重要的角色。它不仅是植物中主要的能量储存形式，也是人类饮食结构的基石，广泛应用于食品、医药、造纸和生物燃料等领域[58]。然而，当前社会面临着日益严峻的气候变化和资源匮乏的挑战，迫切需要寻求更加环保、可持续的生产方式。近年来，酶催化CO2人工合成淀粉的研究备受关注，将CO2引入反应体系，不仅能促进转化过程，还可以将其固定，减缓其对环境的负面影响。同时，将酶催化技术与CO2转化相结合，旨在开发一种环保高效的淀粉合成方法，为淀粉的绿色生产提供有力支持[59]。

2021 年，中国科学院天津工业生物技术研究所马延和团队[60]聚焦于绿色工业制造，在国际上首次不依赖光合作用实现CO2人工合成淀粉，为建立CO2人工生物转化技术体系提供了新思路。该团队采用一种类似“搭积木”的方式，通过化学-生物催化混合策略，在一个无细胞体系中利用CO2和H2合成淀粉。该合成途径（ASAP）由11个核心反应组成，通过路径设计，经过模块化组装以及对三个瓶颈酶进行蛋白工程优化而建立。经过核磁共振检测，发现人工合成淀粉分子的结构与天然淀粉分子一致。初步实验表明，相较于传统农业生产淀粉，人工合成淀粉的生产效率提升了8.5 倍。在充足的能量供给条件下，根据目前的技术参数，一个立方米大小的生物反应器理论上年产淀粉量相当于我国5亩玉米地的年产淀粉量。这条新路线使淀粉生产方式从传统的农业种植向工业制造转变成为可能，为CO2合成复杂分子开辟了新的技术路线。

2.6 CO2转化为其他化学品

在CO2酶催化转化领域，除了已经受到广泛关注的甲醇、甲烷、甲酸和淀粉等化学原料与产品外，还有其他具有潜力的资源化利用途径，例如：L-乳酸、丙酮酸等。L-乳酸作为一种重要的有机酸，在医药、食品、聚乳酸等领域具有广泛的应用前景。Miyazaki 等[61]以乙醛和CO2为原料，采用丙酮酸脱羧酶逆反应和乳酸脱氢酶催化丙酮酸加氢相结合的方法，一锅两步酶促合成L-乳酸。同样地，该团队也以乙醛和CO2为原料，利用啤酒酵母丙酮酸脱羧酶和焦磷酸硫胺（辅因子）的协同作用，成功催化CO2的羧基化反应，合成丙酮酸[62]。2009年，美国洛杉矶加利福尼亚大学Liao等[63]通过基因工程技术改造了Synechococcus elongatusPCC7942 菌株，使其能够直接利用CO2产生异丁醛和异丁醇，并通过表达1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）来提高产物的产量。CO2与脂肪族化合物羧基化反应、菌株的基因改造不仅实现对CO2的高效利用，也为构建绿色、低碳的化工产业链提供了新的可能性。

3 酶催化CO2转化的过程强化

要充分发挥酶在CO2催化转化中的作用，不仅需要深入了解其应用领域，还需要理解影响其催化效率的关键因素，这涉及到诸多复杂的生物催化机制和反应条件优化。根据酶催化固碳过程的本质特征，目前研究报道的该过程的强化技术可归纳为：辅因子的原位再生、酶的固定化、反应条件（pH、温度、底物浓度）优化、反应系统的优化设计以及产物原位脱出分离等。

3.1 辅因子的原位再生

研究表明，将辅因子与酶进行共价结合可以提高酶活性，因此如何高效原位再生辅因子，持续驱动酶催化反应性，降低反应成本，也是酶催化CO2转化反应体系中亟须解决的问题。在调整反应体系中底物排列、优化物质传递的基础上高效原位再生辅因子是提高催化效果的重要举措，中国科学院过程工程研究所Wang 等[64]将CO2级联还原制甲醇多酶集成系统原位封装在聚电解质掺杂的中空纳米纤维管腔中，在管腔侧引入谷氨酸脱氢酶（GDH），通过将各组分进行精确空间排列及区域划分实现NADH的连续再生。结果表明，酶促NADH再生的甲醇产率可达95.3%，无酶促NADH再生时，甲醇产率仅为33.1%。此外，将酶与NADH再生系统整合为一体，以提高局部NADH浓度、促进酶催化反应，这也是优化体系的一大策略。中国科学院天津工业生物技术研究所Zhu 等[65]构建了CO2电还原系统，依赖辅因子NADH 的FDH 催化CO2还原成甲酸，并结合电沉积的铜纳米颗粒（CuNPs）催化NADH 再生。此外，沉积在碳毡（CF）电极上的CuNPs 还可以通过CuNPs 与FDH 表面的半胱氨酸残基（Cys）之间形成Cu—S 键，作为固定化FDH的载体。同时为了增加FDH 附近的辅因子浓度，通过聚乙二醇（PEG）交联形成FDH-NAD+共轭物，缩短了再生NADH 在FDH 和CuNPs 的催化位点之间的移动距离，进而提高局部NADH浓度，促进整体反应，提高CO2的还原速率。当NADH浓度从1mmol/L 增加至4mmol/L 时，甲酸产量增加，与1mmol/L NADH 相比，最佳3mmol/L NADH 的甲酸产量增加约70%。

3.2 酶固定化

在酶法固碳的捕集和转化过程中，游离酶在实际操作环境或极端条件（如高温、强酸强碱或有机溶剂等）下，酶分子容易失活，且不易回收和重复利用，使得酶的工业化应用受到了很大限制。固定化酶技术是指利用载体将酶束缚或限制在一定的区域内，仍能保持酶特有的催化活性的一类技术，该技术可有效克服游离酶的局限性[7,66]。通过选择良好的载体和合适的固定化方法对游离酶进行固定，是提高酶的催化活性、降低催化剂成本、提高稳定性和再利用性的有效途径[67]。

3.2.1 固定化方法

酶固定化是通过物理或化学方法将游离酶与特定的载体材料结合。所构建固定化酶体系的催化效率和稳定性在很大程度上取决于载体的选择以及固定化方法的应用。首要考虑的是在固定化过程中保持酶的活性。按照酶与载体的结合方式，主要分为吸附、共价结合、包埋法、交联法以及近年来发展起来的原位合成法五大类，固定化方法的具体策略与优缺点如表2所示。

表2 固定化方法优缺点

3.2.2 固定化酶的载体

固定化酶的载体[74]主要可归纳为高分子材料、无机材料以及聚合物-无机复合材料。经静电纺丝制备的聚合物纤维具有显著的比表面积[75]，从而可有效增加酶的固载能力。Jun 等[16]成功报道了一种高负载且稳定的BCA，以酶沉淀涂层（EPC）的形式，由酶共价连接固定在电纺聚合物纳米纤维上。沉淀和交联组成的EPC 即使在室温下于水溶液中以200r/min 摇动孵育868 天后仍能保持65.3%的初始活性。无机载体主要有氧化硅[76]和氧化钛纳米粒子[77]、磷酸盐纳米花等。Ali 等[78]通过使用3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES） 对磁性纳米粒子（MNP）表面的氧化硅涂层进行氨基改性，之后将CA 固定在氨基改性的氧化硅涂层表面，重点研究了不同温度（30℃、40℃、50℃）分别对游离酶与固定化酶的活性影响。在不同温度下孵育80min后，固定化酶分别保留89%、93%、35%的初始酶活，而游离酶分别保留79%、56%、24%；该固定化酶在连续使用13 个周期后保留了61%的初始活性。Rasouli等[79]提出一种新型的混合酶促工艺：将HCAⅡ酶固定在填料表面，同时将MNP 分散在生物反应器的液体吸收剂中。通过聚多巴胺/聚乙烯亚胺（PDA/PEI）共沉积实现填料和MNP表面的胺官能化处理，使HCAⅡ能够通过戊二醛固定在改性表面上。即使经过40 天，固定在填料和MNP 上的HCAⅡ仍保持80%和84.7%的初始活性。MOF因具有结构可修饰、孔道可调节、框架可设计等优点，是催化CO2转化酶的优良载体[80]，其中相较于其他MOF 系列，UiO-66-NH2具有更大的比表面积和发达的微孔结构，有利于酶的负载与固定；另一方面，其孔径（0.38～0.55nm）更接近CO2的动力学分子直径（0.35～0.51nm），从而增加CO2的吸附热，同时其极性官能团氨基的存在，可进一步提高对CO2的吸附，这对实现CO2的高效转化至关重要。2022 年，河北工业大学Jiang 等[81]将微孔UiO-66-NH2转化为具有微孔和中孔的多层次多孔结构（HP-UiO-66-NH2），旨在通过优化孔隙结构促进FDH 的固定和CO2富集，CO2富集和电催化NADH再生相结合，提高了酶电催化体系的CO2还原能力，优化后的催化体系3h 内甲酸浓度为1.826mmol/L（是自由酶体系的5.57 倍）。2018 年，天津科技大学的Jia 等[82]成功将CA 通过物理吸附固定在ZIF-8上，固定效率超过95%，同时保持了固定化酶活性的75%。经过9次循环利用后，固定化酶的保留活性约为85%。酶固定后，其构象发生一定程度的变化，从而提升了酶对高温和表面活性剂的耐受性。

3.3 反应系统的优化设计

酶催化CO2转化的过程中，反应器的选择也是一个至关重要的环节。不同类型的反应器在传质特性、温度控制等方面呈现出显著的差异，直接影响到催化效率和产物选择性。因此，为了最大程度地发挥酶的催化功能，必须深入了解各类反应器的特性及其在酶催化转化中的适用性，研究反应系统的流体力学和传质性能，强化相间传质。

3.3.1 传统酶反应器

不同的反应器设计，如鼓泡式反应器（BCR）、流化床式反应器（FBR）、填料床反应器（PBR）等都可以实现酶促CO2生物转化。Iliuta等[83]在填充床反应器内，将游离的HCAⅡ固定在填料表面上并使微粒分散在液相中来增强CO2的水合过程。Chook 等[84]在研究反应器类型对酶生物催化反应的影响时，提出传统反应器通常采用机械搅拌器，通过机械搅拌产生液体的剪切来改善流体的混合，从而提高酶生物催化剂与其他反应物的接触面积。然而，强烈搅拌产生的高剪切作用力会破坏酶固定化系统，影响酶的催化活性。刘晓军等[85]围绕连续流酶反应器展开研究，并提出在化工生产中，连续流工艺相较于分批工艺具有固有的优势，包括质量和传热的改善、催化反应的显著优化、长时间稳定高效的运行。

虽然传统酶反应器已经得到广泛应用，但是仍有酶的利用率低、产物不能及时分离等不足。酶膜反应器（EMR）将生物催化、产物的分离、浓缩及酶的回收等操作步骤结合成一个操作单元，能实现连续生产、不同操作单元的集成，具有显著优势，是近年来反应器研究中的一个重要领域。

3.3.2 酶膜反应器

EMR 的设计需要考虑酶的使用形式与位置，酶既可以以游离的形式使用，也可以以固定的形式来设计EMR。膜的位置也是有所不同，如直接在反应器的底部或位于反应器的外部。1994 年，Prazeres和Cabral[86]基于酶和底物的接触机制将酶膜反应器分为直接接触式酶膜反应器、扩散接触式酶膜反应器、界面接触式酶膜反应器。2022 年，Sitanggang 等[87]指出Prazeres 和Cabral 基于酶和底物的接触机制进行酶膜反应器分类的工作是首篇关于EMR 的评述文章，并根据膜功能、流体动力学，将EMR 分为死端EMR （dead-end EMR）、错流EMR （cross-flow EMR）、界 面EMR （interfacial EMR）、渗析EMR（dialysis EMR），如图1 所示。相对于死端EMR、错流EMR 和渗析EMR，界面EMR 因其固定化酶的稳定性以及结合了膜技术与酶催化的优势而备受关注，在酶催化CO2转化过程中具有广阔的应用前景。

图1 游离酶和固定化酶膜反应器示意图[87]

气液膜反应器作为界面EMR 的一种形式，将液体吸收的高选择性、酶催化与膜分离相结合[88]。在气液膜反应器中，首先将固定化酶在液相悬浮，在CO2通气进入溶液的过程中，要求CO2在固定化酶悬浮的溶液界面鼓泡，确保CO2在溶液中扩散到酶的路径最小化，CO2浓度梯度和传质速率最大化[89]。2017年，澳大利亚新南威尔士大学Chen等[90]受脂质细胞膜Janus 两侧亲水-疏水特性的启发，提出Janus CO2气液膜反应器高效水合和转化策略。纳米级间隔CA 和FDH 被定位在明确的聚丙烯（PP）多孔膜中气-液界面处，具有较高的底物浓度。通过这项工作，证实酶的纳米级联空间布置对于有效反应至关重要。2021 年，该团队[73]同样将CA和FDH原位固定在PDA/PEI改性的PP平板膜上构建多酶级联反应体系，随后通过PDA 中的邻苯二酚基团与金属离子发生螯合作用，以启动晶体原位生长合成ZIF-8薄膜，以还原CO2为HCOOH，在气液膜接触器中催化后的HCOOH 产率为22%，除平板膜以外，界面EMR 常用的膜结构还包括管状和中空纤维膜（HFMs）[87]。

相较于传统鼓泡式反应器中的单喷嘴、多孔板式气体分布器，中空纤维膜以中空微孔膜材料为“芯片”，通过微纳米尺度孔道将气相反应物分散成大量微气泡，是实现物质快速混合和高效传质的重要手段[91-92]。2016年，北京理工大学Zhao 等[93]从反应器设计优化与成本控制出发，首次将疏水聚合物HFMs 作为气体分布器和改性聚乙烯（PE）HFMs作为固定化酶的载体组合在同一模块中，以FDH为催化剂，NADH 为辅因子，构建了HFMs 反应器用于CO2转化为HCOOH。CO2通过疏水HFMs 的膜孔进行曝气（模式1，图2）。研究表明气体分布器HFMs 的孔隙率和表面疏水性等参数对反应有很大影响，当最佳孔隙率约为50%时，聚合物膜水接触角越大，产生的微气泡尺寸越小，反应速度越快。在该团队以往的研究中，共价结合固定FDH制备得到的FDH-PE中空纤维膜反应器采用不同的CO2通气方式[94]，具体为：FDH-PE 短膜丝置于反应溶液中，将CO2以内压方式鼓泡通过一根PE 中空纤维膜丝，该膜丝一端连接气体管道，另一端在反应溶液中开放并在溶液中鼓泡（模式2），该模式的CO2浓度在进口处最大，然后沿膜丝长度方向单调减小，这导致了反应器入口处反应速率最高、选择性却较小，从而影响总产率。与直接通气模式2相比，模式1中CO2注入到HFMs管腔中被高比表面积的微孔HFMs分散成大量的微气泡，气-液-固相间接触充分，相间面积增加，气含率增大，CO2在溶液中的扩散和溶解过程增强。另一方面，大量的可移动微气泡体系在反应器中轴向、径向的运动，引起强烈的扰动，有效增加了液相的湍动，强化了气液两相流的传质特性，显著提高了相间传质效率，促进CO2向甲酸盐的转化。Trachtenberg等[95]设计了一种HFMs反应器来捕集燃烧后烟道气中的CO2。Iliuta 等[96]采用动力学模型在中空纤维膜生物反应器（HFMB）中探索固定化HCAⅡ催化CO2吸收过程。因此，HFM模块被用作酶催化CO2转化过程中的气体分布器和反应器，可以围绕气液两相流中微气泡形成及调控、气液两相流的传质特性等，强化气-液-固多相催化反应过程，其必将成为实现化工过程高效、节能的重要组成。

3.4 反应条件优化

酶作为生物催化剂促进CO2催化转化过程涉及多个反应条件，通过调节反应条件，例如温度、pH、底物浓度等，以最大限度地提高酶催化CO2的效率和产率。可根据具体的酶和反应系统，通过实验优化反应条件，获得更佳的催化效果。

3.4.1 pH

酶催化反应体系的pH 直接影响酶的构象和活性。研究表明，酶催化过程对pH 极为敏感，需要适宜pH[50]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（PCK）是植物基础代谢途径的主要酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）草酰酸的反应[27]。产丁二酸放线杆菌以秸秆糖为碳源固定CO2过程中，PCK是其转化关键酶，该关键酶对环境pH变化较敏感，当pH为6.5～7.0 时酶活性较高。因此在发酵过程中应及时添加中和剂，否则生成过量丁二酸会造成发酵液pH 过低，进一步抑制酶活性影响发酵[97]。2012年，中国科学院兰州化学物理研究所华绍烽等[98]采用共沉淀法制备磁性壳聚糖微球作为载体固定FDH，并在30oC 时，测定酶在pH=2～10 的缓冲液中的活力。随着pH 的增加，相对酶活力先升高后降低；游离酶最适宜反应pH=7，由于微环境表面电荷性能的影响，固定化酶的最适宜反应pH=6，向酸性方向偏移。FDH 经过固定后，在碱性和酸性溶液中稳定性均有明显提高且固定化酶的pH适应范围扩大。在强酸（pH=2）和强碱（pH=10）条件下，固定化酶的相对酶活分别为11.03%和38.43%，然而游离酶已全部失活。这是由于磁性壳聚糖微球的物理吸附和共价交联作用，使蛋白质构象发生变化，对酶的结构起保护作用，使其不容易被破坏。2019年，美国西北大学Farha 等[99]将FDH 封装在锆基MOF（NU-1006）中，FDH@NU-1006 活性不受pH 降低的影响，说明NU-1006在酸性环境下对FDH具有保护作用。这是因为NU-1006 的孔径（6.2nm）与FDH 的动力学直径（6nm×4nm×11nm）几乎一致，可促进FDH 和MOF 内部之间的范德华相互作用，进而通过避免酶的脱落使其免于失活，耐酸性明显增强。酶的活性与其特定的三维结构密切相关，而pH 会改变溶液中的氢离子浓度，从而影响蛋白质的电荷状态，这种电荷状态的改变会引起酶蛋白质结构的变化，进而影响其催化活性[12]。

3.4.2 温度

温度直接影响酶的催化速率和稳定性。酶的活性与其分子振动状态密切相关，而温度的升高会增加分子的振动程度，从而提高酶催化反应速率，然而，过高的温度也容易导致酶的失活。近年来，由酶生物矿化诱导结晶的MOF，热稳定性强，可作为酶周围的保护层提高其在高温下的稳定性。Chai等[73]将CA和FDH原位包埋在以PP或陶瓷为基材制备的ZIF-8 涂层中，用于CO2气液膜接触器，经过4h 反应，HCOOH 产率达到22%。在100℃沸水中孵育1h 后，ZIF-8 中的CA@FDH 活性基本保持稳定，而游离酶的活性则完全丧失。在150℃空气中暴露1h 后，活性从55%降至45%，经过7 次循环后保持在60%左右。2018年，郑州大学Zhang等[100]基于CA 稳定性差的局限性，利用CA 的金属活性位点，将CA 和金属磷酸盐自组装合成杂化纳米花（M-CANF，M 代表Mn2+、Ca2+、Cu2+）。研究表明M-CANF 具有良好的生物催化活性和稳定性，MCANF在30oC下，没有任何活性损失，在50oC下均保持60%以上的生物活性，特别是Ca-CANF 可重复使用性和热稳定性显著提高。

3.4.3 CO2底物浓度

在酶催化反应中，底物CO2浓度直接影响催化反应的速率和产物产量，因此在催化反应中，提高催化体系中CO2底物浓度非常关键，主要体现为三方面：CO2压力、气体流量、通入方式。2020 年，天津大学Ma 等[101]利用高速摄像机研究多通道微反应器中CO2在甘氨酸钠水溶液中的气液分布和传质特性，提出CO2的吸收效率随气体流量的增加先增大后减小。同样地，也有研究人员提出在少量酶负载条件下，气体流量是影响CO2吸收的主要因素[102]。在北京理工大学Zhao等[94]的研究中，探讨了两种不同的CO2通入方式，即加压和膜丝鼓泡，对中空纤维膜固定化FDH 催化CO2合成甲酸的影响。比较结果显示，采用鼓泡法的情况下，在反应进行9h后，反应收率达到了2.39%，而加压法的反应收率仅为0.36%。鼓泡法明显促进了CO2在水中的溶解和扩散过程，有利于CO2的转化。此外，随着鼓泡装置孔径的减小，CO2在水中的溶解传质系数也相应增大[103]。同样地，该团队在CA 促进CO2转化为HCOOH 过程中，优化反应条件[40]，其中CO2压力从0.2MPa 增加到0.5MPa 时，反应速率由(1.20±0.09)×10-3mol/min 增 加 到(2.17±0.07)×10-3mol/min，当压力进一步增加到1.0MPa 时，反应速率变化不大。CO2压力对反应的影响主要体现在两个方面：溶液中底物浓度和反应压力。一方面，由于反应平衡不利，较高的压力绝对有利于HCOOH 的生成[104]；另一方面，CO2压力越高，CO2在反应溶液中的溶解度越高。

3.5 产物原位分离

产物原位分离（in situproduct separation，ISPS）是将分离单元与生物催化反应系统直接结合的混合生物过程，主要目的是通过产物分离，以改变热力学不利的反应体系的表观平衡[105]。同时，ISPS 可以有效地减少产物的抑制作用、避免副反应，进而提高产率。

酶催化芳香酸的脱羧反应及逆向的芳香烃羧基化反应（即科尔贝-施密特反应）在常压水相体系中进行，可以解决传统科尔贝-施密特反应需要剧烈反应条件的难题。但是，在常压水相体系中反应的热力学平衡使得反应的转化率很低，即使在最优条件下仍低于50%。2015 年，中国科学院天津工业生物技术研究所生物催化与绿色化工研究团队[106]用含有芳香酸脱羧酶的重组大肠杆菌作为生物催化剂，在体系中添加沉淀剂季铵盐，羧基化产物会形成铵盐，铵盐会不断沉淀，将间苯二酚和邻苯二酚的反应平衡向羧化方向推动，解决了可逆平衡反应转化率低的问题，使对间苯二酚和邻苯二酚的羧化转化率可达97%。首次实现了酚类化合物的酶促羧化反应，为二氧化碳绿色固定及有机芳香酸的绿色合成提供了新途径。Ohde等[107]以CO2作为碳源，在根瘤菌中的2,6-二羟基苯甲酸脱羧酶（2,6-DHBD）将间苯二酚羧化成2,6-二羟基苯甲酸（2,6-DHBA）的过程中，利用三乙醇胺（TEA）获得较高的CO2底物浓度，并添加溴化四丁基铵（TBA-Br）用于使产物2,6-DHBA 原位沉淀，提高平衡转化率和反应速率。研究表明，在0.14mol/L TEA、350mmol/L TBA-Br 和80mmol/L 间苯二酚进行羧化反应时，平衡产率提高了36.8%。

依赖于疏水性树脂的吸附与离子交换也是常用的减少产物抑制的途径。Larachi 等[108]研究在Robinson-Mahone 反应器中固定化HCAⅡ对CO2的催化水合作用。为了增加CO2的水合动力学，提高催化水合效果，介绍了两种去除液相中HCO-3的方法。第一种策略为通过氯化钙使其原位沉淀生成CaCO3，然而其转化率并没有提高，可能是由于酶埋藏在CaCO3沉淀物下；另一种方法是用37～74μm 或200～400 目的球形离子交换树脂吸附HCO-3，CO2转化率提高两倍，效果显著。然而，这种过程强化策略可能难以在装载填料的大型填料床中实施。因此，Iliuta 和Larachi 等[109]提出了一种多尺度（通道-酶涂层-树脂）模型，研究在固定HCAⅡ的三相（气-液-固）整体式浆态反应器中催化CO2水合及离子交换原位去除HCO-3。离子交换原位去除HCO-3是通过浆液型离子交换树脂（强碱型阴离子交换树脂，IRN-150）吸引负电荷离子，从而减少产物抑制。当树脂浓度为10kg/m3，CA浓度从2mg/L增加到12mg/L时，CO2的转化率增加了30%。

4 结语与展望

CO2的高效利用已成为国内外研究的热点和前沿。构建生物体外酶催化固碳体系，实现CO2向能源物质，如CO、甲烷、甲醇及其他重要化学品的转化，将成为降低大气中CO2浓度的有效途径之一。本文一方面介绍用于酶催化CO2生物资源化利用的关键酶及其优化，并阐述了其典型应用，尤其是CH4、CH3OH、HCOOH、淀粉等高附加值化学品。另一方面，聚焦于酶催化固碳的过程强化技术，主要有辅因子的原位再生、酶的固定化、反应系统的优化设计、反应条件优化（pH、温度、底物浓度）以及产物原位分离等对酶催化性能的影响，强化生物催化反应过程，实现CO2的高效固定与资源化利用。综上所述，从实验室到工业生产，酶催化与工业碳排放结合的过程中，关键步骤为CO2的高效溶解和传质过程的优化。首先引入有机胺等利用其化学亲和性实现液相中CO2富集，并结合微气泡技术、加压等调控气液两相流的传质特性，强化气-液-固多相催化反应过程，同时在反应过程中，采用产物原位分离技术，提升多相催化反应中CO2的转化率。酶催化固碳体系的构建有效提升碳捕集效率，为降低碳排放做出实质性的贡献。

现阶段，以工业应用为目标的生物催化固碳领域的主要发展瓶颈为:①开发高稳定性和低成本的酶催化剂；需揭示载体材料、结构及其制备条件等对酶反应特性等方面的影响规律，解析酶催化和载体构建过程中的协同调控机制，为高性能工业生物催化提供理论指导；②建立催化过程中关键参数对催化转化产物的调控机制；需揭示各参数单独调控机制及相互影响规律；建立过程的动力学模型，优化条件，实现CO2的高效转化。基于酶催化的固碳技术仍需不断改进和创新，在未来的研究中，酶催化CO2转化制备乙二醇、L-乳酸、二羟基丙酮、丙烯酸等化学品是值得重点关注的方向；并且，应集中于光-酶、电-酶、新型纳米催化剂以及它们的协同催化[110]，实现结构的耦合和性能的提升，是酶催化CO2转化领域的发展趋势，以实现能源物质及有用化学品的可控制备。