槲皮素对大鼠心肌梗死后左心室重塑的改善机制研究*

罗 建,朱 彬△,刘应才,范新荣,魏 燕

(1.泸州市中医医院心血管内科,四川泸州 646000;2.西南医科大学附属医院心血管内科,四川泸州 646000;3.西南医科大学心血管医学研究所,四川泸州 646000)

心室重塑是心室应对心脏负荷状态而发生的慢性结构改变,表现为心脏大小、形态和功能发生改变,临床上最终导致心力衰竭,给患者及社会带来巨大经济负担。心室重塑分为向心性、离心性及心肌梗死(myocardial infarction,MI)后重塑,其中MI是心室重塑的首要危险因素,主要集中在高血压、肺动脉高压、主动脉瓣狭窄、糖尿病等方面[1]。MI后心室重塑机制与炎症反应、机械刺激、心肌肥厚、心肌纤维化、肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活、交感神经兴奋、氧化应激、能量代谢异常等相关[2]。目前,临床上逆转MI后心室重塑的主要药物包括炎症细胞因子抑制剂、肾素-血管紧张素-醛固酮系统阻断剂、交感神经受体阻断剂、钠-葡萄糖共转运蛋白2抑制剂、他汀等[3]。槲皮素(quercetin,Que)是自然中一种常见的黄酮类化合物,有研究表明其可通过抑制炎症等机制对心脏产生保护作用[4-8],也可降低肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的释放来减少大鼠心肌缺血再灌注损伤[9]。由于MI后心室重塑与心肌缺血再灌注损伤有大致相同的发病机制[10],故推测Que对MI后心室重塑亦具有保护作用。因此,本研究探讨Que对大鼠MI后心室重塑的保护作用及其对TNF-α和IL-6的影响,并为临床上治疗MI后心室重塑的新药开发提供新的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

30只健康清洁级SD雄性大鼠购于四川达硕实验动物有限公司[动物合格证号:SCXK(川)2015-030],8周龄,体重约200 g。所有大鼠于动物房中饲养,环境温度20～24 ℃,湿度45%～50%,12 h光照和12 h暗循环,保持环境通风,及时清理粪便,更换垫料,提供充足饮水及饲料,适应饲养7 d后进行实验。

1.2 仪器与试剂

槲皮素购于德国默克公司;TNF-α、IL-6抗体及其对应ELISA试剂盒均购于武汉博士德生物公司;Masson染色试剂盒及SP免疫组织化学染色(IHC)试剂盒购于四川源康盛科技有限公司;小动物呼吸机及气体麻醉机购于深圳瑞沃德生命科技有限公司;切片机及包埋机购于德国徕卡仪器有限公司;数字切片扫描仪(KF-PRO-002)购于宁波江丰生物信息技术有限公司;FUJIFILM Vevo 3100高分辨率小动物超声影像系统购于日本富士胶片公司;Cytation 5多功能酶标仪购于美国伯腾仪器有限公司;低温高速离心机购于德国艾本德股份公司。

1.3 方法

1.3.1喂养与分组

将大鼠随机分为Sham组、MI组、Que组,每组各10只。采取结扎左前降支的方法制造大鼠急性MI模型,术前12 h禁食,自由饮水。异氟烷气体持续麻醉大鼠,经口行气管插管,呼吸机辅助呼吸,连接心电图机持续监护,后行开胸手术,在左心耳与肺动脉圆锥之间找到冠状动脉,在左心耳下方2～3 mm处用丝线永久性结扎冠状动脉,观察心电图变化。结扎线以下区域可见颜色变白,心肌收缩减慢,同时Ⅰ导联、aVL导联ST段向上抬,并且出现频发的室性心律失常,则提示结扎成功,仔细缝合伤口并消毒。Sham组只穿线,不结扎。Que组在制造MI模型后每天予以Que 100 mg/kg口服,MI组及Sham组普通喂养,连续喂养4周。

1.3.2心脏超声检查

末次喂养24 h后,异氟烷气体持续麻醉大鼠,在标准设置下进行二维经胸超声心动图检查,在3个连续的心动周期内测量并计算出左心室舒张末期容量(LVEDv)、左心室收缩末期容量(LVESv)、左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS)。

1.3.3血清炎症细胞因子检测

超声检查结束后,开胸行心脏采血,于4 ℃、3 000 r/min离心10 min,收集上清液,按照ELISA试剂盒说明书进行血清TNF-α和IL-6水平检测。

1.3.4Masson染色评估大鼠心肌纤维化

采血完成后,立即取心脏置于4%多聚甲醛中固定12 h,然后经乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡后使用组织包埋机包埋,再使用组织切片机切片。心脏采用横切面,从左心耳下方2～3 mm处心室往心尖方向切片,厚度约为5 μm。将切片固定于载玻片。心脏切片脱蜡,反复水洗,苏木精液染核,丽春红复红,苯胺蓝蓝染,冰醋酸浸洗,乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固,完成Masson染色。

1.3.5IHC染色观察心肌炎症细胞因子水平

根据SP试剂盒说明书,心脏石蜡切片脱蜡,修复抗原,清除内源性过氧化氢酶,封闭抗体,分别加入1∶500的TNF-α和IL-6一抗,4 ℃过夜,二抗孵育,DAB显色,苏木素复染,脱水,透明,封片,完成IHC染色。

1.3.6切片扫描

所有切片采用数字切片扫描仪扫描,并导出图片进行分析。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 Que改善MI后左心功能

心脏超声结果提示,与Sham组比较,MI组大鼠LVEF和LVFS均明显降低,LVEDv和LVESv均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与MI组比较,Que组左心功能明显改善,LVEF和LVFS均明显升高,LVESv明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),见表1、图1。

图1 各组心脏超声图

表1 各组间心脏超声结果比较

2.2 各组左心室心肌纤维化情况比较

MI组较Sham组左心室心肌纤维化程度升高,而Que组较MI组左心室心肌纤维化程度降低,见图2。

红色为正常心肌组织,蓝色为纤维化心肌组织。

2.3 各组血清及心肌组织炎症细胞因子水平比较

与Sham组比较,MI组大鼠血清TNF-α和IL-6水平均明显升高(P<0.05),心肌组织中TNF-α和IL-6浸润均明显增多;与MI组比较,Que组大鼠血清IL-6和TNF-α水平均明显降低(P<0.05),心肌组织中TNF-α和IL-6浸润均明显减少,见表2、图3～4。

图3 各组IL-6的IHC染色结果(40×)

图4 各组TNF-α的IHC染色结果(40×)

表2 各组间ELISA及IHC结果比较

3 讨 论

机体遭受急性MI后,立即发生应激性炎症反应,旨在清除坏死心肌细胞,随后进入抗炎阶段,表现为纤维化修复心脏,防止发生急性心脏破裂等并发症,但却最终导致心室重塑,进一步甚至会进展为心力衰竭[11]。

MI后机体受到心肌局部炎症细胞因子浸润和全身神经炎症反应双重攻击,这是MI后心室重塑的重要机制之一[12]。参加大鼠MI后心室重塑的促炎因子主要有TNF-α和IL-6[13]。JING等[14]发现,IL-6基因敲除小鼠MI后心肌中的TNF-α表达会明显下调,且可通过激活M2巨噬细胞和减少成纤维细胞胶原蛋白生成来改善心脏重塑。WANG等[15]证实IL-6在急性MI大鼠模型中可刺激心肌纤维化,最终导致心室重塑,而IL-6抑制剂可逆转此过程。CEN等[16]发现麝香保心丸通过下调MI大鼠TNF-α和IL-6的表达,进而抑制心肌细胞的超微结构变化,改善心功能和心室重塑。此外,急性MI患者血液中TNF-α和IL-6水平明显升高,卡托普利和缬沙坦可有效降低炎症水平,改善患者心室重塑[17]。

有研究证明,50、100、400 mg·kg-1·d-1的Que连续喂养大鼠7 d均可降低MI大鼠循环中TNF-α水平,具有抗炎、抗氧化和抗凋亡作用,可有效降低心肌损伤[18-19]。ALBADRANI等[20]发现,50 mg/kg的Que连续喂养大鼠30 d可逆转大鼠MI后左心室重塑,其主要通过心肌组织转化生长因子β1/Smad3通路来实现。王兴红等[21]研究发现,予以30、60 mg·kg-1·d-1的Que连续灌胃7 d预处理心肌缺血再灌注大鼠,可明显降低大鼠血液中TNF-α和IL-6水平,减少MI面积。LIU等[22]发现,再灌注时予以10 nmol/L的Que灌注10 min后,可明显降低大鼠缺血再灌注模型冠状动脉流出液中TNF-α和IL-6水平,改善心功能。刘振华等[23]发现,再灌注前15 min静脉注射10 mg/kg的Que可明显降低大鼠心肌缺血再灌注模型循环中的IL-6水平。何亚磊等[24]采用25、50、100 mg·kg-1·d-1的Que连续喂养大鼠7 d制造心肌缺血再灌注模型,发现血液中TNF-α和IL-6水平明显降低,MI面积明显减少。LIU等[25]采用250 mg/kg的Que预处理大鼠心肌缺血再灌注模型,发现可明显降低其循环中的TNF-α水平。这与本研究结果一致。

本研究发现,Que可改善MI大鼠LVEF及LVFS,降低LVESv及左心室心肌纤维化程度,明显改善大鼠MI后左心室重塑[26];此外,Que明显降低MI大鼠循环中及心脏组织中TNF-α和IL-6表达水平,说明Que减轻大鼠MI后左心室重塑机制可能还与抑制炎症细胞因子TNF-α和IL-6的释放相关。但是本研究局限于动物实验,且研究样本较少,需进一步开展更大规模的临床研究,为临床新药开发提供更充实的理论依据。