添加单宁酸和原花青素对油菜氮素利用率和氧化亚氮排放的影响

景悦杨，王珊珊，张新星，吴 迪，高志岭,2

（河北农业大学 资源与环境科学学院 / 河北省农田生态环境重点实验室，河北 保定 071000）

随着现代农业的发展，氮肥施用在提高农作物产量、品质的同时，也引起了农田土壤N2O 的大量排放，据报道，全球农田N2O 排放约占人为源排放量的60%～70%［1-3］。N2O 不仅由于其增温潜势是CO2的265 倍［4］，是全球增温的重要贡献者，且排放量已经远超将全球增温控制在2 ℃的要求［5］，同时N2O 也是导致平流层大气中臭氧浓度降低主要原因之一。因此，降低农田土壤N2O 排放对于减缓全球变暖、增加平流层臭氧浓度等具有重要意义。

研究表明，农田N2O 产排受土壤硝化、反硝化菌及相应功能基因的综合调控，除了气候和土壤环境条件、农艺管理措施等之外，施用硝化抑制剂、脲酶抑制剂等通过改变土壤中AOA、AOB（amoA）等硝化过程以及narG、nirK、nirS和nosZ等反硝化菌功能基因丰度等途径可以有效降低N2O 排放［6-10］。此外，还可以通过直接施用N2O 还原细菌降低土壤N2O 排放［11］。

近年来，随着循环农业的蓬勃发展，农业系统内部（种植和养殖）、跨系统（农业和食品加工等）的废弃物循环利用日趋普遍［12-13］。针对根系分泌物-微生物-土壤氮循环的研究发现，某些植物根系分泌物可抑制土壤氮素转化过程［14-16］。例如，大豆根系分泌物苯甲酸（酚类化合物）可以通过影响反硝化细菌来抑制土壤反硝化过程中N2O 的排放［17-18］。植物根、茎、叶等器官中广泛存在着原花青素、单宁酸等物质，它们可通过根系分泌、植物落叶以及其加工副产物（提纯后的残渣）等方式进入土壤并影响土壤氮循环过程，此外，单宁类物质也会随着牛粪还田（降低反刍动物瘤胃甲烷排放）而进入农田［19］。室内培养研究表明，由于单宁（包括缩合和水解单宁）或含有单宁类物质的植物落叶等物质具有抗菌抑菌的特性［20-21］，施用原花青素等单宁可以抑制酸性土壤中微生物的活性以及N2O 排放［22-23］。

已有研究表明根系分泌物可以通过影响酸性土壤微生物来影响土壤N2O 的排放［18,24］，但尚未有原花青素、单宁酸等物质对北方碱性中土壤氮素转化、N2O 排放以及作物产量影响的研究。因此，本研究拟采用盆栽试验，探索原花青素和单宁酸用量对北方石灰性土壤上油菜产量、氮素利用率以及N2O 排放的影响，研究结果将对农业废弃物绿色安全循环利用以及农田N2O 减排具有重要的理论指导和技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试土壤与药品

1.1.1 供试土壤 本试验所用土取自河北省保定市河北农业大学三分厂（115°4′E，38°8′N），地处温带大陆性季风气候，海拔约21 m。土壤类型均为潮褐土，土壤容重为1.28 g/cm3，pH 为7.99，全氮为1.3 g/kg，NH4+-N 为4.34 mg/kg，NO3--N 为3.6 mg/kg；该地区属于暖温带大陆性季风气候，历年平均气温为12 ℃，平均降雨量为498.9 mm。土壤样品经自然风干后除去植物残渣和沙石，过2 mm 筛备用。

1.1.2 供试材料 原花青素、单宁酸、尿素

1.2 试验设计

室内盆栽试验采用装置如图1 所示。

图1 气体采样装置Fig.1 Illustration of the incubation and measurement setup

试验装置为内长30 cm，内宽20 cm，内高15 cm 的塑料盆。盆中土壤回填高度为10 cm，并根据土壤容重、土壤密度及土壤孔隙度准确计算土壤饱和含水量进行灌溉，调整土壤含水量至土壤孔隙含水量为60%，将油菜幼苗移栽到试验装置内，每盆中的油菜幼苗数为12 棵，之后进行缓苗。施氮量以田间施氮量230 kg/hm2进行折算添加，氮肥及原花青素、单宁酸在四叶一心期添加。根据氮肥的用量，设置4 个原花青素浓度进行土壤硝化潜势的测定，其结果如表1 所示。因此在本试验中，设置3 个原花青素浓度，分别为0、0.1、0.2 g/kg 干土，分别记为UR、PC1、PC2，单宁酸浓度与原花青素相同，记为UR、TA1、TA2，每个处理3 个重复。额外设置一组重复，用于土壤取样，进行土壤理化性质的测定。本试验在(25±1 )℃模拟温室中进行，试验期间根据失水量2 ～5 d 进行1 次浇水。

表1 原花青素及单宁酸对土壤硝化潜势的影响Table 1 Effects of procyanidins and tannic acids on soil nitrification potential

1.3 样品采集与测定

1.3.1 气体的采集与测定 本研究于每天上午8:00-9:00 进行气体样品采集。测定时关闭密封盖连接外部空气的三通阀，使之形成一个密闭的静态箱。将50 mL 的注射器与三通阀相连，进行气体采集。箱体封闭后在0 和30 min 时取气30 mL，将取好的气体注入提前抽好真空的10 mL 真空瓶中，用气相色谱仪（Agilent6820）测定N2O 的浓度，设置色谱检测器为ECD，检测温度为330 ℃［25］。共培养45 d。

N2O 排放通量计算公式：

式中：F 为N2O 排放通量（mg/m2·h）；dCt/dt为箱内气体随时间变化的斜率（mg/m3·h）；H为箱内气体高度；T0为标准状态下空气的绝对温度（K）；T为实际空气温度（℃）［26］。

N2O 累积排放量计算公式：

式中：Q为试验期间盆栽中N2O 排放总量（mg/m2）；n为测定期间的测定次数；i为根据时间排序的采样测定时间；Fi为第i次测定时N2O 的排放通量（mg/m2·h）；ti+1为第i+1 次测定时的时间（h）；ti为第i次测定时的时间（h）。

1.3.2 土壤和植株采集与分析测定 在第1、4、15、30、45 d 采集土壤样品，测定土壤NO3--N、NH4+-N、NO2--N 含量以及土壤pH、EC、WSOC 等指标。土壤NO3--N、NH4+-N、NO2--N 以及土壤pH的测定参照《土壤农化分析》。NO3--N 含量采用KCL 浸提并结合流动分析仪进行测定；NH4+-N 含量采用靛酚蓝比色法进行测定；NO2--N 含量采用N-（1-萘基）-乙二胺比色法进行测定；pH 值用pH计进行测定（水土比为2.5∶1）；土壤EC 用电导率仪进行测定；土壤WSOC 采用焦磷酸钠比色法进测定。培养45 d 后收获，收获后测定植株的鲜重及干重。

1.4 数据统计

采用SPSS 20.0 和Microsoft Excel 2021 软件对数据进行作图和统计分析，均值采用单因素方差分析LSD、邓肯多重比较（α=0.05）对试验数据进行比较分析，以P＜0.05 表示各组间存在显著性差异。

2 结果与分析

2.1 原花青素对土壤N2O 排放通量及累积排放量的影响

如图2 所示，各处理N2O 排放均呈现先上升后下降的趋势。与UR 处理相比，PC1、PC2 处理显著抑制了土壤N2O 的排放。各处理土壤N2O 排放通量均在第4 天达到峰值，在排放高峰时，与UR 处理相比PC1、PC2 处理的排放通量分别降低了32.4%与22.4%。各处理N2O 排放通量在第20 天以后趋于稳定，在此过程中UR 处理的N2O 排放通量均高于其他3 个处理。从累积排放量上来说，UR 处理的N2O 累积排放量达到了13.20 mg/m2，相较于UR，PC1 与PC2 处理N2O 的累积排放量分别显著降低28.1%和33.0%。

图2 原花青素对土壤N2O 排放的影响Fig.2 Impact of the procyanidins on soil N2O emission

2.2 单宁酸对土壤N2O 排放通量及累积排放量的影响

如图3 所示，各处理N2O 的排放趋势与图2 基本相同。与UR 处理相比较，TA1 和TA2 处理对土壤N2O 的排放通量以及累积排放量均有显著抑制作用。各处理土壤N2O 排放通量均在第4 天达到峰值，在排放高峰时，与UR 相比，TA1 与TA2 的排放通量分别降低了16.4%与20.7%；从累积排放量上来看，3 个处理之间也存在显著差异，UR 处理的N2O 累积排放量显著高于其他2 个处理，与UR 相比，TA1 与TA2 处理的N2O 累积排放量分别降低了32.9%与41.5%。

图3 单宁酸对土壤N2O 排放的影响Fig.3 Impact of the tannic acid on soil N2O emission

2.3 原花青素及单宁酸对土壤无机氮转化的影响

2.3.1 原花青素对土壤NH4+-N、NO2--N 及NO3--N 含量的影响 由图4 可以看出，随着培养时间的增加土壤中NH4+-N 含量呈现出直线下降的趋势，在培养的第4 天，PC1、PC2 处理土壤中NH4+-N 含量显著高于UR 处理，各处理在第15 天以后趋于平稳；土壤中NO2--N 与NO3--N 则呈现先上升后下降的趋势，土壤中NO2--N 含量在培养的第4 天达到最高，并且UR 处理显著高于其他处理，之后呈现下降趋势，在第15 天趋于稳定状态；土壤中NO3--N含量峰值出现较晚，在试验的前15 d，土壤中NO3--N 含量呈现上升趋势，UR 处理土壤中NO3--N 的生成速率显著高于其他处理，并且在培养的第15 天呈现出明显差异，之后土壤中NO3--N 含量呈现下降趋势。

图4 原花青素及单宁酸对土壤无机氮的影响Fig.4 Impacts of procyanidins and tannic acid on the inorganic N contents in soils

2.3.2 单宁酸对土壤NH4+-N、NO2--N 及NO3--N 含量的影响 由图4 中可以看出，当单宁酸添加进土壤后，土壤中无机氮含量变化趋势与添加原花青素处理的变化趋势大致相同，在培养的第4 天时TA1、TA2 处理土壤中NH4+-N 的含量均显著高于UR 处理；土壤中NO2--N 含量在培养的第4 天时达到最高，并且UR 处理与其他处理呈现显著差异，在培养的第15 天之后，土壤中NO2--N 含量趋于稳定，且各处理间无显著差异；土壤中NO3--N 含量变化有所差异，UR 和TA1 处理土壤中NO3--N 的含量在第15 天达到最高，而TA2 处理土壤中NO3--N 的含量在第4 天达到最高，之后表现为下降的趋势。所有处理在第30 天均下降到较低水平。综上所述，添加原花青素与单宁酸均可以显著影响土壤中氮素的转化。

2.4 原花青素及单宁酸对土壤pH 的影响

添加原花青素及单宁酸的处理与UR 处理无显著差异，因此，原花青素及单宁酸对土壤pH无显著影响。

2.5 原花青素及单宁酸对土壤电导率的影响

由图5 中可以看出，土壤EC 均呈现先上升后下降的趋势。在添加原花青素与单宁酸的培养试验中，培养的前15 d 土壤EC 呈现上升的趋势，并且在培养的第15 天时，各处理间呈现出差异，在第15 天之后，均表现为下降趋势。

图5 原花青素及单宁酸对土壤EC 的影响Fig.5 Impacts of procyanidins and tannic acid on soil EC

2.6 原花青素及单宁酸对土壤可溶性有机碳的影响

由图6 中可以看出，在添加原花青素的培养试验中，土壤中可溶性有机碳含量没有发生较大变化，处理之间无显著差异。在添加单宁酸的培养试验中，土壤中可溶性有机碳含量略微升高的趋势。在培养的前4 d，UR 处理土壤中可溶性有机碳含量显著高于TA1 与TA2 处理，并且 TA2 处理显著低于TA1处理。在第4 天之后的培养试验中，各处理之间差异不显著。

图6 原花青素及单宁酸对土壤WSOC 的影响Fig.6 Impacts of procyanidins and tannic acid on soil WSOC

2.7 各处理对油菜生物量及氮素利用率的影响

如表2 所示，与UR 处理相比，PC1、PC2 、TA1 与TA2 处理的油菜干重显著高于UR 处理，但各处理之间无显著差异，对比添加PC 与TA 的处理，添加TA 处理的产量略高于PC。

表2 各处理对油菜生物量及氮素利用的影响Table 2 Effects of different treatments on biomass and nitrogen utilization of rape

添加原花青素与单宁酸也显著提高了植物中氮素的含量以及氮素利率，由表2 中可以看出，PC1、PC2 与TA1 处理油菜含氮量高于UR 处理，但与其无显著差异，而TA2 处理显著高于UR 处理。添加原花青素与单宁酸显著提高了植物的氮素利用率，并且随着添加量的增加，对氮素的利用效率有所增加，对比添加原花青素和单宁酸可以看出，添加单宁酸的处理对氮肥的利用率要高于添加原花青素的处理。

3 讨论

3.1 原花青素及单宁酸对土壤N2O 排放的影响

本研究结果表明，在碱性土壤中，原花青素及单宁酸对土壤N2O 排放通量及累积排放量有显著抑制作用。主要原因可能有：（1）硝化与反硝化过程在很大程度上决定了土壤N2O 的排放，本研究证实了原花青素与单宁酸均显著抑制了土壤NH4+-N 的转化，这可能是因为添加单宁会抑制或减少微生物丰度导致氮矿化速率降低［27］，并且在抑制硝化过程发生的同时，减少了反硝化过程的底物。（2）在土壤氮循环过程中，需要多种酶的相互作用。研究发现，酚酸类物质添加到土壤可能会导致土壤中脲酶、多酚氧化酶、酸性磷酸酶活性等活性的降低［28］，这与单宁的蛋白质沉淀能力有关［29-30］。（3）缩合单宁还可通过结合螯合有机氮源也可以非生物地减少矿物质氮循环［31］，使高分子量缩合单宁对土壤净氮矿化速率和净硝化速率有显著抑制作用，这也可能是导致土壤N2O 排放量降低的原因之一。此外，土壤中可溶性有机碳含量也是影响土壤微生物构成的因素之一，但在本试验中，各处理之间土壤WSOC 含量差异并不显著，由此说明，添加原花青素与单宁酸并没有造成土壤WSOC 含量的变化，从而对土壤N2O 的排放造成影响。在本研究中，土壤中N2O 的排放受到了显著抑制，其原因可能是单宁抑制了土壤中相关酶的活性，但具体抑制了哪些酶的活性仍需进一步探究。

3.2 原花青素及单宁酸对油菜产量及氮素利用率的影响

由于植物单宁是一种重要的化感物质［32］，可能会抑制植物或作物的生长发育［33-35］，但在本研究中，添加原花青素与单宁酸不仅没有抑制油菜的生长，还增加了油菜产量和氮素利用率，这与De Klerk 等研究结果相吻合，推测其原因可能是当单宁用量尚未达到抑制根系发育和生长的临界用量（＞3 000 μmol/L）时，有助于提高土壤中生长素、细胞分裂素和赤霉素等植物激素的含量［36］，尤其是可能通过其抗氧化特性阻止土壤中IAA（吲哚乙酸）的脱羧降解，维持或提高土壤IAA 提高含量，促进植物根系不定根的发育和生长，最终导致油菜生物量和氮素利用率均显著上升［37］。此外，本研究还发现，添加缩合单宁处理也显著提高了油菜产量和氮素利用率，这可能是原花青素类物质可以维持细胞膜、防止蛋白变性，并作为自由基清除剂保护植物等特性有关［38-39］。相较而言，添加缩合单宁处理的油菜氮素利用率要稍低于水解单宁处理，但添加单宁酸的油菜产量要略高于添加原花青素，这或许与水解单宁具有更高的不稳定性和生物降解性有关［40-41］。

综上所述，在本研究中发现添加原花青素与单宁酸不仅可以抑制了土壤N2O 的排放，还提高了油菜氮素利用率，这为原花青素及单宁酸与尿素配施以及富含原花青素物质的跨系统循环利用提供了新视角和新思路，但仍需在碱性土壤中开展更多的田间原位研究，进一步探索其可行性。

4 结论

本研究探索了添加原花青素及单宁酸对油菜产量、氮素利用率以及土壤N2O 排放的影响。发现施用原花青素、单宁酸不仅可降低土壤NO2-和NO3-等无机氮含量，还使得油菜生育期N2O 排放分别降低了28.1%～33%和32.9%～41.5%，而蔬菜产量增加了7.9%～17.9%，油菜的氮素利用率提高了5.0%～9.71%。由此可见，在北方石灰性土壤施用原花青素、单宁酸可实现油菜高产、高效以及温室气体减排等多重目标，这为富含原花青素、单宁酸等植物提取物以及富含上述物质的农业废弃物的安全循环利用、北方石灰性农田土壤N2O 减排提供了新思路和新途径。