基于网络药理学及分子对接技术探究三棱-莪术配伍在卵巢癌辅助治疗中的作用机制*

李鸿博，石丹宁，张杜娟，张 璐，李 翡△

1 陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000； 2 陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；3 北京中医药大学生命科学学院，北京 100029

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是女性生殖系统常见的三大肿瘤之一，由于其发病早期多无典型临床症状，约70%的患者在确诊时已属晚期［1-2］。针对卵巢癌，临床上常采用手术联合放、化疗的方案进行治疗，不幸的是，虽然进行了及时的干预，但晚期卵巢患者的5 年生存率仍不足50%［3-4］。一项关于中国癌症的统计显示，在2015 年，中国女性中卵巢癌患者达到5.21 万例，死亡人数达到2.25 万例［5］。此外，全球每年新发卵巢癌约为22.5 万例，且发病年龄趋于年轻化［6］。怎样降低卵巢癌术后复发，提高患者5 年生存率，成为卵巢癌治疗的研究重点。尽管新辅助化疗、靶向治疗等方法在临床上得到重视，但患者耐受性程度不同或由于靶向单一，以至于无法满足所有类型卵巢癌患者的治疗需求，使得上述疗法在临床上的应用有一定局限性。

近年来，中医药以其独特的优势，在肿瘤的辅助治疗中发挥着重要作用。中医学古籍中虽无对“卵巢癌”一词的记载，但其临床症状和体征与《黄帝内经》中描述的“肠覃”相似，概属中医妇科“癥瘕”范畴。治疗该类病证，中医多采用活血化瘀，消积化癥之法。通过研究临床常用于辅助治疗卵巢的中药复方，发现常用方剂理冲生髓饮、益气活血解毒汤、复方大七气汤等，均属临床中辅助治疗卵巢癌的常用方剂［7-9］。分析其组方发现，以上方剂中均含有“三棱-莪术”药对。三棱，味苦，性平，归肝、脾经。其功效为破血行气，消积止痛，常用于治疗癥瘕痞块，瘀血经闭，胸痹心痛等证；莪术，味辛、苦，性温，归肝、脾经，亦有破血行气，消积止痛之效，常用于治疗血瘀腹痛、积聚、妇女血瘀经闭等。临床上，该药亦广泛应用于其他妇科肿瘤的治疗中，可发挥抑制肿瘤细胞增殖和转移、调节机体免疫等作用。

为了探究三棱-莪术药对治疗卵巢癌的潜在机制，本研究采用网络药理学，筛选三棱-莪术的有效成分及其作用靶点，通过生物功能及通路富集等分析其潜在的作用机制，此外，使用分子对接技术深入研究核心成分及关键靶点的相互作用，以期为三棱-莪术配伍的临床应用提供新的理论依据，为临床辅助治疗卵巢癌以及开发新药提供新的参考。

1 资料与方法

1.1 “三棱-莪术”药对的活性成分及作用靶点的筛选基于中药系统药理学分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）［10］，检索三棱及莪术两味中药的化学成分，筛选生物口服利用度（oral availability，OB）≥30%，且类药性（drug-likeness，DL）≥0.18 的化合物，同时收集其作用靶点。利用R软件，并基于Uniprot数据库将化合物作用靶点转换为规范基因名。

1.2 卵巢癌相关基因的筛选并获取“药物-疾病”交集基因通过Genecard 数据库，以“ovarian cancer”为关键词进行检索，得到7946 个与卵巢癌相关的基因，根据相关性评分，筛选评分≥10 的基因进行后续研究。将得到的1541 个与卵巢癌相关的基因与三棱-莪术药对的靶基因取交集，得到27 个“药物-疾病”交集基因，并绘制韦恩图以展示二者的联系。

1.3 构建“药物-疾病”交集基因蛋白互作网络以获取关键基因将“药物-疾病”交集基因导入STRING 11.0［11］，获取该27 个靶点的蛋白质互相作用网络，同时运用Cluster 功能将交集靶点进行聚类分析，进一步阐述交集靶点间的紧密关系。此后，将PPI 网络导入Cytoscape 3.6 软件中，利用Cytohuba插件对PPI进行进一步的分析以确定关键基因。

1.4 基因本体论（gene ontology，GO）与京都基因和基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析应用在线富集分析软件（WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit，http：//www.webgestalt.org/）对“疾病-药物”重合基因进行GO 富集分析，富集内容主要包括生物过程（biological process，BP）、细胞组成（cellular component，CC）及分子功能（molecular function，MF）三个部分，并以P＜0.01 为获取标准，根据其富集程度及显著性，对筛选结果进行可视化处理。此外，应用R 软件进行KEGG 通路富集分析，并通用Cytoscape 软件中的ClueGo 富集分析插件以P＜0.01 为筛选标准，对通路富集结果进行聚类分析。

1.5 构建网络图应用Cytoscape 3.6.0 软件，分别构建“中药-成分-疾病-靶点”网络及“靶点-通路”网络，进一步分析三棱-莪术配伍在治疗卵巢癌过程中发挥作用的核心成分、关键基因及信号转导过程，以阐释其作用的潜在机制。

1.6 核心成分与关键基因的分子对接根据“中药-成分-疾病-靶点”网络及PPI 互作网络的分析结果，将活性成分及作用靶点按degree 高低进行排序，选择排序前两位的化合物以及核心靶点，在RSCB PDB 数据库中选择相应的靶点蛋白结构并下载pdb 格式文件。根据TCMSP 中化合物分子的结构图，在ChemDraw 3D 软件中绘制核心成分结构图。通过AutoDockTools 软件将靶点蛋白和化合物分子配体进行处理，再通过AutoDock-Vina计算结合能，输出对接结果，应用Pymol 及Discovery Studio进行数据可视化。

2 结果

2.1 三棱-莪术的活性成分与作用靶点的筛选通过TCMSP 数据库筛选，共得到三棱活性成分30个及莪术活性成分81个。符合筛选条件OB≥30%，DL≥0.18 的活性成分分别为三棱5 个，莪术3 个。在TCMSP中分别输入这8个活性成分，获取其潜在的作用靶点，去重后得到60个靶点。见表1。

2.2 卵巢癌相关靶点及“疾病-药物”重合靶点的获取通过Genecard 数据库，以“ovarian cancer”为关键词，检索到人类相关基因共7946 个，根据基因与疾病相关性评分，筛选评分≥10 的基因，得到1540 个与卵巢癌相关的基因。三棱-莪术作用于卵巢癌的潜在靶点，见表2。将三棱-莪术靶点与卵巢癌相关基因取交集，共得到27 个“疾病-药物”交集基因。见图1。

图1 三棱-莪术与卵巢癌交集靶点Venn图

表2 三棱-莪术药对治疗卵巢癌核心靶点

2.3 蛋白互作（Protein-Protein Interaction，PPI）网络构建与分析通过STRING 数据库构建这27 个重合基因的PPI 网络，分析显示该网络中共有27 个节点（nodes），124 条边（edges），其中PRSS1 基因与其他各基因之间无互相作用，见图2。选取剩余26 个基因导入Cytoscape 3.6.0 软件中，应用Cytohubba插件，分析上述26个基因中的关键节点。其中JUN，CASP3，ESR1，PTGS2 等基因互作频次最高，靶点之间的相互作用强，degree值大，在该互作网络中具有重要作用，说明上述基因可能为三棱、莪术活性成分在卵巢癌治疗中的潜在作用靶点。见图3。

图2 通过STRING数据库构建PPI网络图

图3 PPI网络图

2.4 “中药-活性成分-疾病-靶点”网络构建将获得的中药、活性成分、疾病、靶点等相关信息通过R 软件进行分析，其结果通过Cytoscape 3.6.0软件进行可视化处理，获得“中药-活性成分-疾病-靶点”网络。该网络共包括节点35 个，其中中药2个，活性成分5个，靶点27个，疾病1个。结果充分提示三棱、莪术中活性成分与卵巢癌多靶点作用的特点。通过分析网络发现，在三棱诸成分中，与治疗卵巢癌这一作用相关性最高的前三位活性成分依次为：芒柄花黄素，β-谷甾醇，豆甾醇，而在莪术诸成分中，发挥主要作用的成分为常春藤皂苷元。见图4。

图4 中药-活性成分-疾病-靶点网络图

2.5 GO 功能注释与KEGG 信号通路富集分析通过在线富集分析软件进行GO 富集后，得到结果如图5所示。结果显示，药物-疾病重合基因参与的生物过程主要包括代谢过程、刺激反应、生物调节等；参与的细胞组成主要包括膜包围的内腔、细胞核、细胞质基质等；参与的分子功能主要包括蛋白质结合、离子络合、核酸结合等。通过R软件进行KEGG通路富集分析，共得到104条相关通路（P＜0.05）。根据其富集程度排序后筛选前20 条通路进行可视化处理得到如图6 所示的气泡图，结果显示疾病-药物重合基因主要神经退行性病变、乙肝、HIV病毒感染、卡波济肉瘤相关疱疹病毒感染、人巨细胞病毒感染、IL-17 信号通路、雌激素信号通路等相关。此外，应用Cytoscape/Clue Go 软件对重合基因以P＜0.01，Kappa 系数=0.4 为标准进行KEGG通路聚类分析，结果如图7所示，进一步提示三棱、莪术在卵巢癌的治疗中可能主要通过调控IL-17 信号通路、凋亡信号通路、雌激素信号通路等来达到治疗目的。

图5 GO富集分析

图6 KEGG通路富集分析

图7 KEGG通路聚类分析

2.6 “三棱-莪术”核心活性成分与关键靶点的分子对接综合“中药-活性成分-疾病靶点网络”及PPI 互作网络，选取三棱的核心成分芒柄花黄素（formononetin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）与莪术的核心活性成分常春藤皂苷元（hederagenin）分别与PPI网络排名前十且与核心成分相关联的靶点进行分子对接模拟研究。对接结果如表3所示，各分子间亲和力均小于-7 kcal/mol，说明分子间具有良好的对接活性。其中，芒柄花黄素、β-谷甾醇及常春藤皂苷元与PTGS2 对接时，亲和力均小于-9.0 kcal/mol，对接活性极佳，这表明PTGS2 很可能是三棱-莪术药对治疗卵巢癌的潜在靶点。使用Pymol及Discovery Studio软件分析对接结果并将结果进行可视化，分子间作用力由2D 图展示，见图8-10，其中PTGS2 与β-谷甾醇相互作用的Vina Score（即结合能）最佳，为-9.3 kcal/mol。结合图9 可以看出，β-谷甾醇与PTGS2蛋白之间通过丰富的π-烷基疏水键形成较为稳定的结构。其次，芒柄花黄素与PTGS2（结合能为-9.1 kcal/mol）依靠氢键、π-烷基疏水键、π-阴离子键等形成较为稳定的结构。

图8 芒柄花黄素与对应靶点对接结果

图9 β-谷甾醇与对应靶点对接结果

图10 常春藤皂苷元与对应靶点对接结果

表3 三棱-莪术中活性成分与其对应靶点的结合能kcal/mol

3 讨论

手术及术后放化疗依然是目前临床治疗卵巢癌的主要手段。长期以来，中医药在妇科各类疾病的治疗中具有举足轻重的地位，尤其在恶性肿瘤的治疗过程中，手术及放化疗后配合中医药辅助治疗，可明显缓解副作用给患者带来的痛苦［12］。此外，坚持口服汤药的患者，5 年生存率明显高于未经中医药治疗的患者［13-14］。卵巢癌在中医妇科学中属“癥瘕”范畴，其证成因多为瘀血凝滞。三棱、莪术二药均有破血行气、消积止痛之效，善缓结消癥，可治血瘀腹痛及妇女血瘀经闭等，但由于中药本身多成分、多靶点的特性，使其作用机制的详尽阐述颇为困难。网络药理学是近年来基于系统生物学的一种新兴研究方法，能够较为系统地探讨中药及其复方多成分、多靶点的作用机制［15-16］，为研究中药带来全新的思路。

本研究采用网络药理学结合分子对接技术的研究方法，较为全面地探究了治疗卵巢癌常见配伍三棱-莪术的活性成分及其潜在靶点。通过构建并分析“中药-成分-疾病-靶点”网络图，结果发现芒柄花黄素、β-谷甾醇、常春藤皂苷元是三棱-莪术药对发挥治疗卵巢癌作用的关键活性成分。芒柄花黄素（formononetin），又称刺芒柄花素或芒柄花素，是一种生物活性异黄酮，是常用中药当归、黄芪、三棱等的活性成分之一。研究表明，芒柄花黄素具有保护血管、抗炎、抗焦虑、抗肿瘤［17］等多种活性。其中，抗肿瘤活性，尤其是其抗卵巢癌的活性，近年来备受研究者们关注。古彩茹等［18］通过体外实验发现，芒柄花黄素能够抑制卵巢癌细胞SKOV-3 的迁移和侵袭，其作用机制可能是通过芒柄花黄素增加了E-cadherin 并降低MMP-9 的表达实现的。顾万等［19］同样利用SKOV-3细胞进行了体外实验研究，结果显示芒柄花黄素能够通过调节凋亡蛋白Bax 及抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达，诱导卵巢癌SKOV-3 细胞的凋亡。常春藤皂苷元（Hederagenin）是一种五环三帖酸类化合物，具有抗肿瘤［20］、抗抑郁［21］等药理作用和生物活性。左方等［22］通过体外实验发现，常春藤皂苷元能够抑制乳腺癌细胞MCF-7 的增殖，诱导凋亡和减少侵袭，其作用机制分别涉及调节PCNA、Bcl-2/Bax 及MMP-9 的表达；此外，研究表明常春藤皂苷元表现出对宫颈癌细胞［23］、胃癌细胞［24］等多种肿瘤细胞明显的抑制作用，然而，其在卵巢癌中的药理作用尚未见报道。β-谷甾醇是一种植物甾醇，存在于包括天麻在内的多种中草药之中，可在人体内发挥多种有益的作用，其所表现出的抗肿瘤作用逐渐成为天然药物的研究重点［25］。与常春藤皂苷元类似的是，尽管β-谷甾醇能够作用于多种肿瘤细胞，发挥抑制肿瘤细胞增殖或诱导其凋亡的药理作用［26］，但在卵巢癌细胞中的作用尚未见报道，这将为我们日后的研究提供一些参考。

芒柄花黄素、常春藤皂苷元及β-谷甾醇分别与PPI网络中排名前十的靶点进行分子对接后，活性成分与其对应靶点的结合能均小于-7.0 kcal/mol，说明以上活性成分与其对应靶点结合性良好。其中，PTGS 是上述三种活性成分的共同靶点，且其对接结合能均小于-9.0 kcal/mol，表明活性成分与PTGS2 之间具有较强的结合力。前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2），又称环氧化酶2（cyclooxygenase-2，COX-2），是前列腺素生物合成的关键酶，兼有环氧化酶和过氧化物酶的作用。近年来，越来越多的研究显示，COX-2 在人类多种肿瘤中呈异常表达，且能够在肿瘤的发生、发展及肿瘤细胞对放化疗的敏感性中发挥多方面的作用［27］。选择性COX-2 抑制剂也被作为一种新型的抗癌药得到了广泛关注和研究［28］。研究表明，在卵巢癌患者中，COX-2 的表达显著增多，且其高表达往往与卵巢癌的不良预后相关［29］。此外，COX-2能够通过调节上皮间质转化从而促进卵巢癌细胞迁移，同时增强了患者对顺铂的耐药性［30］，而选择性COX-2抑制剂塞来昔布能够显著降低由于COX-2高表达而引起的卵巢癌细胞迁移和耐药性［31-32］，这说明COX-2 作为卵巢癌治疗的潜在靶点，值得进一步探究。然而，COX-2 抑制剂在临床使用中所带来的心脑血管及消化系统损伤等副作用［33-34］亦不容忽略，因此，若能进一步阐明三棱-莪术及其活性成分这类天然成分对PTGS2 的作用，将对COX-2 抑制剂在肿瘤治疗中的应用带来一些新的参考。

在对关键基因进行KEGG 通路富集研究后，我们发现这些关键基因主要与神经退化信号通路、乙型肝炎、HIV-1 感染、凋亡信号通路、卡波济肉瘤相关疱疹病毒感染、EB病毒感染、人巨细胞病毒感染、IL-17 信号通路、雌激素信号通路等信号转导途径具有较强的关联。将这些相关通路进行聚类分析后发现，这些信号转导途径主要分为以下几类：卵巢类固醇生成、甲状腺激素信号通路、雌激素信号通路、白细胞介素17（interleukin 17，IL-17），信号通路、凋亡信号通路、乙肝及利什曼病。这说明三棱-莪术药对在发挥对卵巢癌的辅助治疗作用时，可能主要是通过上述信号转导机制来实现的。IL-17 是主要由T 细胞的亚型Th17细胞分泌产生的炎症相关性细胞因子。研究表明，无论是否是炎症相关性肿瘤，炎症因子均是抑制肿瘤炎性作用的重要介质，能够促进肿瘤相关性炎性，使肿瘤细胞逃避免疫监控［35-36］。IL-17 是近年来备受关注的促炎细胞因子，在包括卵巢癌在内的多种恶性肿瘤中，均存在IL-17 的高表达［37-38］，因此，IL-17 及其介导的信号通路在卵巢癌的研究中逐渐受到广泛关注。在本研究中，我们发现三棱-莪术药对在卵巢癌的辅助治疗中可能与IL-17信号通路密切相关，这一发现值得通过后续实验研究进行更为深入的探究。

总而言之，卵巢癌的发生与发展往往涉及多靶点、多通路、多环节。临床中，在使用靶向药物治疗时，逐渐发现了单靶点药物的局限性，因此，多靶点的药物治疗成为研究者新的研究方向［39-40］。基于网络药理学及分子对接技术，对三棱-莪术药对在卵巢癌辅助治疗中的作用机制的探讨，充分体现了三棱-莪术所发挥的多成分、多靶点的作用特点，为后续进一步的研究提供了参考。