滋月萃降糖方介导Fetuin B-AMPK/ACC 通路对高脂诱导肥胖小鼠肝脏胰岛素抵抗的调控机制研究*

刘曼曼，冯珍凤，胡春平，陈见纺，沈怡华，高俊凤，严 军△

1 上海市嘉定区中医医院，上海 201899； 2 上海中医药大学研究生院，上海 201203

近年来，肥胖导致的代谢综合征发病率逐年增长［1］。肥胖是由于能量摄入大于消耗导致的一种代谢障碍状态，受到生活状态、环境、遗传等多种因素的共同影响。而胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）是其发病的关键因素，并贯穿发病过程的始终。肝脏在全身代谢调节中发挥着至关重要的作用，肝脏IR 导致的代谢紊乱是影响机体葡萄糖和脂质代谢的关键［2］。Fetuin B 是近年来新发现的半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员之一，是一种新型的肝脏分泌蛋白，由肝脏产生分泌入血［3］。研究表明，Fetuin B增多会引起糖代谢和脂代谢异常，且Fetuin B 在体内长期积累会增加罹患IR的风险，但其在代谢中的具体作用机制尚不明确［4-5］。腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）即丝氨酸/苏氨酸激酶AMP 依赖的蛋白激酶，是一种重要的能量感应酶，是调节机体能量代谢的总开关。乙酰辅酶A 羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）是一种依赖生物素的变构羧化酶，是AMPK 的下游分子，AMPK/ACC 通路抑制可加重IR，从而加剧葡萄糖和脂质代谢紊乱。最新的一项研究表明，Fetuin B抑制胰岛素信号传导，加重心肌缺血再灌注损伤。大量研究表明，在啮齿动物中，心肌缺血再灌注损伤可通过激活AMPK/ACC通路改善心肌IR，起到保护心脏的作用［6-9］。

滋膵降糖方是上海市嘉定区中医医院内分泌科的临床经验方，相关临床研究证实滋膵降糖方可有效改善2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者高体质量及IR［10-11］，但具体机制仍需进一步研究探索。本实验采用高脂饮食诱导建立C57BL/6J小鼠IR模型，观察其肝脏组织Fetuin B及AMPK、ACC相关表达，计算糖耐量曲线下面积（area under ROC curve，AUC）和胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment-estimated insulin resistance，HOMA-IR），从新的角度探讨滋膵降糖方改善IR的相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物选择SPF 级健康C57BL/6J 小鼠50只，6周龄，雄性，体质量18～22 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：北京百善SCXK（京）2016-0006，实验动物使用许可证号：北京SYXK（京）2017-0033。饲养条件：动物饲养于北京维通利华实验动物技术有限公司上海分公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0011；实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2017-0014。SPF 级实验动物设施IVC 系统，动物房温度（22±5）℃，相对湿度（50±10）%，明暗周期12 h∶12 h，鼠笼每日清洁消毒，所有小鼠自由饮水，自由饮食。动物饲料为60%Kcal High-Fat（DIO）Diet（美国RDI，货号：D12492）。本实验经上海中医药大学伦理会委员会批准。

1.2 实验药物滋膵降糖方组成：生黄芪20 g，山萸肉10 g，山药15 g，生地黄15 g，黄连6 g，葛根15 g，鬼箭羽10 g。上述颗粒制剂购自上海市嘉定区中医医院药剂科，批号：20190863。盐酸二甲双胍片（格华止）（中美上海施贵宝制药有限公司，国药准字H20023370）。

1.3 试剂与仪器小鼠胰岛素ELISA 试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，批号：CSB-E05071m）；RIPA 裂解液（上海碧云天生物技术公司，批号：P0013，P0033），ECL 发光剂（上海碧云天生物技术公司，批号：P0018S）；BCA试剂盒［生工生物工程（上海）股份有限公司，批号：C503021］；AMPKα1（批号：ab32047）、P-AMPKαT183/T172（批号：ab133448）、ACC（批号：ab45174）、P-ACCS79（批号：ab68191）Antibody均购自英国abcam公司；内参抗体GAPDH（英国abcam公司，批号：ab9485；成都正能生物技术公司，批号：AF7021）；Fetuin B Antibody（成都正能生物技术公司，批号：384299）；HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit（南京诺唯赞生物科技技术股份有限公司，批号：R212-02）。卓越型罗氏血糖仪（上海鱼跃医疗设备公司）；GL-20G-II 型高速恒温冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；ATPIO-650D 型超声波细胞粉碎机（南京先欧生物科技有限公司）；微量移液器（日本NICHIRYO 公司）；SLAN-96P 全自动医用PCR 分析系统（上海宏石医疗科技有限公司）；Thermo-117123001 型酶标仪（美国赛默飞公司）；GENE GNOME SYNGENE BIO IMAGING（美国Bio Tek Instruments，Inc公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 模型制备 小鼠适应性喂养1 周后，随机选择40只小鼠进行造模，10只小鼠作为空白对照组，给予普通饲料；其余40 只给予高脂饲料建立IR模型，每周进行体质量称量记录，持续时间为8周。造模结束后，所有小鼠隔夜禁食，次日尾静脉取血行空腹注射葡萄糖耐量实验（intraperitioneal glucose tolerance trial，IPGTT），根据IPGTT实验结果及糖耐量曲线判断IR模型建立是否成功（AUC高于正常组均值的小鼠视为IR模型小鼠）［12］。

1.4.2 分组及给药 按照标准，造模成功的小鼠共32 只，采用随机数字表的方法将造模成功的小鼠分为模型组、滋膵降糖方组、二甲双胍组和联合组，每组8 只。按人标准体质量60 kg，人的每日服药量是91 g/60 kg=1.52 g/kg，根据黄继汉《药理实验中动物间和动物与人间的等效剂量换算》的药物和人的体质量剂量系数，换算为1.52×12.33/1000=0.0187416。空白对照组和模型组给予0.9%生理盐水灌胃，滋膵降糖方组给予滋膵降糖方18.741 g/kg 灌胃，二甲双胍组给予二甲双胍混悬液0.103 g/kg 灌胃，联合组给予滋膵降糖方联合二甲双胍灌胃，持续给药4周。

1.4.3 标本取材 小鼠给药4周后，隔夜禁食8 h，予戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，眼球取血，离心，取上清，-20 ℃冰箱保存，以备后续实验；快速取出肝脏，并称质量，-80 ℃冰箱保存，以备后续实验。

1.5 观察指标

1.5.1 小鼠一般情况监测 实验过程中，每天观察并记录小鼠的毛色、饮食、饮水及二便情况、精神状态，每周定时记录小鼠体质量，直至给药结束。

1.5.2 血清胰岛素（fasting insulin，FINS） 以小鼠胰岛素酶联免疫试剂盒测定小鼠血清胰岛素浓度，严格按照试剂盒使用说明书进行操作。根据公式计算胰岛素抵抗指数HOMA-IR［13］。

1.5.3 IPGTT 给药4 周后，行IPGTT。隔夜禁食，25%葡萄糖溶液腹腔注射，于注射前（0 min），注射后30、60、120 min 时分别测定血糖水平，根据梯形公式计算AUC［14］。

1.5.4 Q-RT-PCR法检测小鼠肝脏Fetuin B-AMPK/ACC 通路mRNA 表达 取小鼠肝脏组织100 mg，加入液氮研磨后备用。使用Trizol试剂提取小鼠肝脏组织总RNA，按照HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 说明书操作，去除基因组的DNA，将总RNA 逆转录成单链cDNA，进行实时荧光定量PCR，配制PCR 反应体系，每个基因做3 个复孔和1个阴性对照，在PCR 分析仪上进行DNA 扩增，扩增反应条件为变性（95 ℃，30 s）、退火（58 ℃，30 s）、延伸（72 ℃，30 s）30个循环。以β-actin 为内参基因，校正目标基因的荧光强度。所有引物由上海东寰生物科技有限公司设计合成。见表1。

表1 q-RT-PCR引物序列

1.5.5 Western Blot法检测小鼠肝脏Fetuin BAMPK/ACC通路蛋白表达 取小鼠肝脏组织100 mg，液氮研磨后加入含有97%RIPA+1%PMSF+1%蛋白酶抑制剂+1%磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液及相关抑制剂中，匀浆液离心，4 ℃，12 000 r/min，3 min，取上清。按照BCA 蛋白质浓度测定试剂盒完成蛋白定量；制备聚丙烯酰胺凝胶，并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），将蛋白转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，37 ℃下在封闭液中封闭PVDF膜1 h，洗膜，将膜放在一抗稀释液中（按说明书稀释），4 ℃冰箱孵育过夜。次日用TBST 洗膜3 次，每次15 min。将洗好的膜放入稀释好的二抗中（按说明书稀释），室温孵育1 h，用TBST 洗膜3 次，每次15 min。显影：ECL 发光试剂盒显影，用GENE GNOME 系统曝光显像，导出图片，用ImageJ 软件对条带进行灰度值分析，以GAPDH为内参蛋白，校正目的蛋白灰度值。

1.6 统计学方法采用SPSS 24.0 软件对数据进行处理，计量资料采用表示，满足正态性、方差齐性的计量资料采用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t检验；满足正态性，不满足方差齐性时，组间多重比较用Dunnett′s T3 检验。不满足正态性、方差齐性的计量资料用非参数的秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠体质量、肝质量及肝体比给药4 周期间，滋膵降糖方组、二甲双胍组和联合组与模型组相比小鼠体质量增加缓慢（P＜0.05），滋膵降糖方组小鼠体质量（自给药第3 周开始）明显低于模型组（P＜0.05）；末次给药后，模型组小鼠体质量、肝脏质量和肝体比明显高于空白对照组（P＜0.01）；滋膵降糖方组、二甲双胍组和联合组肝脏质量和肝体比明显低于模型组（P＜0.01）。见表2。

表2 各组小鼠体质量、肝质量、肝体比比较（）

表2 各组小鼠体质量、肝质量、肝体比比较（）

注：与空白对照组比较，▲表示P＜0.01；与模型组比较，*表示P＜0.05，△表示P＜0.01

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2.2 小鼠FINS、HOMA-IR 水平与空白对照组比较，模型组小鼠FINS、HOMA-IR显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，滋膵降糖方组、二甲双胍组和联合组FINS、HOMA-IR 均明显下降（P＜0.01）。见表3。

表3 各组小鼠血清FINS水平、HOMA-IR比较（）

表3 各组小鼠血清FINS水平、HOMA-IR比较（）

注：与空白对照组比较，▲表示P＜0.01；与模型组比较，△表示P＜0.01

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2.3 小鼠IPGTT水平与空白对照组比较，模型组小鼠各个时间点的血糖值均显著升高（P＜0.01），AUC 明显增大（P＜0.01）。与模型组比较，联合组及二甲双胍组能显著降低0、30、60、120 min 时间点的小鼠血糖水平（P＜0.05）；滋膵降糖方组有效改善0、120 min 血糖（P＜0.05）。与模型组比较，给药各组的AUC显著减少（P＜0.05）。见表4。

表4 各组小鼠IPGTT水平比较（）

表4 各组小鼠IPGTT水平比较（）

注：与空白对照组比较，▲表示P＜0.01；与模型组比较，*表示P＜0.05，△表示P＜0.01

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2.4 小鼠肝脏Fetuin B、AMPK、ACC mRNA 相对表达量与空白对照组比较，模型组小鼠Fetuin B，ACC mRNA表达升高（P＜0.01），AMPK mRNA表达降低（P＜0.01）；与模型组比较，滋膵降糖方组、二甲双胍组和联合组Fetuin B、ACC mRNA表达均下降（P＜0.01），AMPK mRNA 表达明显上升（P＜0.01）；其中联合组优于滋膵降糖方组、二甲双胍组（P＜0.05），滋膵降糖方组优于二甲双胍组（P＜0.05）。见表5。

表5 各组小鼠肝脏Fetuin B、AMPK、ACC的mRNA表达比较（）

表5 各组小鼠肝脏Fetuin B、AMPK、ACC的mRNA表达比较（）

注：与空白对照组比较，▲表示P＜0.01；与模型组比较，△表示P＜0.01；与滋膵降糖方组比较，#表示P＜0.05；与二甲双胍组比较，*表示P＜0.01

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2.5 小鼠肝脏Fetuin B-AMPK/ACC 通路蛋白表达与空白对照组比较，模型组小鼠Fetuin B蛋白表达明显增加，P-AMPKαT183/T172/AMPKα1，P-ACCs79/ACC水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠肝脏Fetuin B蛋白表达均下降，P-AMPKαT183/T172/AMPKα1、P-ACCs79/ACC水平升高（P＜0.05）。组间比较，联合组下调Fetuin B蛋白表达，上调P-AMPKαT183/T172/AMPKα1、P-ACCs79/ACC水平效果优于滋膵降糖方组、二甲双胍组（P＜0.05），滋膵降糖方组上述指标改善优于二甲双胍组，上调P-AMPKαT183/T172/AMPKα1水平优于二甲双胍组（P＜0.05），但上调P-ACCs79/ACC水平与二甲双胍组无差异（P＞0.05）。见表6、

表6 各组小鼠肝脏Fetuin B、P-AMPK/AMPK、P-ACC/ACC蛋白表达比较（）

表6 各组小鼠肝脏Fetuin B、P-AMPK/AMPK、P-ACC/ACC蛋白表达比较（）

注：与空白对照组比较，▲表示P＜0.01；与模型组比较，△表示P＜0.05；与滋膵降糖方组比较，#表示P＜0.05；与二甲双胍组比较，*表示P＜0.01

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图1 各组小鼠肝脏FetuinB、P-AMPK/AMPK、P-ACC/ACC蛋白表达电泳图

3 讨论

IR 是肥胖、T2DM 等代谢性疾病发病的核心机制，肝脏是胰岛素作用的主要靶器官之一［2］，由于糖代谢异常往往伴有脂代谢紊乱，IR 又会加重糖脂代谢异常，因此改善肝脏IR 是预防、控制代谢性疾病的有效机制。由于饮食结构的改变，糖尿病等代谢性疾病的临床特征已经发生了极大变化，以IR 及糖脂代谢紊乱的患者为主体人群。中医传统意义上的“三消”理论及“阴虚为本、燥热为标”的基本病机已不能完全概括其病因病机及基本的发生发展规律。若长期过食、少动，易引起食郁，继而郁久化热，耗气伤阴，加之食郁伤脾，脾运化失司，最终导致气阴两虚［15］。故基于前人理论，笔者提出了现代糖尿病代谢性疾病的核心病机为气阴两虚为本，郁热为标。并以晚清医家张锡纯名方“滋膵饮”为基础方加减创制效方“滋膵降糖方”。方中以黄芪为主药，补中益气；生地黄滋肾清热，上以润肺，协同山萸肉以封固肾关；山药善治消渴，性甘平，益肾补脾阴，止小便频数，且润肺生津止渴，与甘温偏于补脾阳之黄芪配合，一阴一阳，气阴兼顾；鬼箭羽活血通络，推陈致新，并使补益药补而不壅滞；葛根、黄连清热滋脾。全方寒温并用、补泻兼施、阴阳相济、气阴双补、标本兼治，诸药并用行健脾益气，清热养阴，活血通络之功。前期研究证实该方除可改善患者高血糖、高血脂和高体质量状态外，还可改善IR 及胰岛β细胞功能［10-11］。

Fetuin B 被证实是一种影响糖脂代谢的重要新型肝脏细胞因子，基因位于鼠16 号染色体，人3 号染色体，而该位点是糖尿病等代谢疾病的遗传基因易感位点［16-17］。RUTH等［18］研究发现，高脂饮食诱导小鼠肝原代细胞胰岛素敏感性受损，是因脂肪变性改变肝细胞的蛋白分泌，Fetuin B分泌异常增多所致。一项基于人群的临床研究发现T2DM 患者的Fetuin B 水平显著升高，与FINS、HOMA-IR 呈正相关［19］。这与研究结果一致，提示Fetuin B 在促进IR 中发挥重要作用。XING 等［6］研究表明，T2DM 小鼠敲除Fetuin B 基因后，心脏Fetuin B 水平降低，胰岛素受体底物1、丝氨酸位点磷酸化增强，心肌组织胰岛素信号传导改善，进而心肌缺血再灌注损伤得以缓解。故Fetuin B被认为是T2DMIR中的关键因子。

AMPK 是一种高度保守的蛋白激酶，是能量代谢调控中枢，作为调节糖脂代谢的关键酶，参与葡萄糖、脂肪酸的合成和氧化分解，在正常生理状态下，AMP/ATP比率上升时，AMPK就被激活，抑制消耗能量的生物合成途径，激活产生ATP的分解代谢途径，调节细胞能量代谢平衡［20］。在高血糖、高血脂的病理环境下，AMPK下调导致正常生理调节机制发生紊乱，信号通路相关蛋白调控发生改变，反而激活下游靶点ACC的活性，加重T2DM的发生。如上所述，XING等［6］研究发现，在T2DM小鼠心肌缺血再灌注损伤模型中伴随Fetuin B水平增加，心肌IR加重。而众所周知，心肌缺血再灌注损伤中，能量代谢AMPK/ACC 通路发挥关键作用。因此推测Fetuin B是调控AMPK/ACC 通路的关键上游靶点，影响机体糖脂代谢。体内Fetuin B 含量增加会抑制AMPK 磷酸化，因AMPK活性降低进一步抑制ACC磷酸化，导致ACC活性增强，抑制脂肪酸氧化，刺激脂质沉积，降低胰岛素敏感性，加剧IR，加重T2DM的进展。本实验结果中，高脂饮食诱导肥胖小鼠HDF较Nor组肝脏Fetuin B、ACC在mRNA和蛋白水平均显著升高，AMPK 则明显降低，肝脏脂肪变性与葡萄糖代谢紊乱加重，证实了以上推测。同时，肥胖小鼠给予滋膵降糖方干预后，Fetuin B mRNA 和蛋白表达下降，刺激AMPK 活化，抑制ACC 活性，加快脂肪酸氧化和糖酵解，改善IR，我们认为可能与其清热、助脾运化散精功能密切相关，而这正与糖尿病中医发病机制一致。

本研究初步阐明了滋膵降糖方可能通过介导Fetuin B-AMPK/ACC 通路对肝脏IR 进行调控，但由于时间限制，仅进行了体内表型研究，下一步研究将结合体外细胞研究进一步验证。