荧光探幽：聚集诱导发光在体外诊断领域的应用

解巧丽 李亚伟 刘勇 王志明

聚集诱导发光（aggregation-induced emission， AIE）材料具有良好的生物安全性、优异的光学性质、出色的光敏性能、独特的单分子多功能性以及易于合成和功能化修饰等特点，在环境监测、食品质量控制、健康诊断、生物成像、光电器件、光学诊疗等领域受到青睐。基于AIE材料的体外诊断产品，如即时检测产品、化学发光检测产品、分子检测产品以及免疫组织化学产品已被逐步开发出来。

即时检验产品

即时检验（point-of-care testing， POCT），其特征是检测时间短，占用空间小，对检测操作者的要求低。POCT应用项目从最初的血糖检测、妊娠检测，扩展到免疫快速分析检测、分子快速分析检测以及血气检测。其中，免疫快速分析检测是一种结合了免疫学原理和层析技术的创新性的方法。免疫标志物与疾病之间关系的不断发现，快速推动了该方法学的发展。

免疫层析技术（immunochromatographic assay， ICA）是建立在层析技术和免疫学反应基础上的一种快速免疫分析技术。免疫层析产品通常以硝酸纤维膜为特异性抗体（或抗原）固化载体，以结合垫为标记探针载体，通过毛细管作用使液体样本在层析试纸条上移动，在载体上发生特异性抗原抗体反应，根据检测线的信号情况来对样本进行定性、半定量或定量分析。

标记材料的发展，决定了免疫层析技术的发展方向。第一代标记材料以胶体金、乳胶微球为代表，免疫层析产品则主要用来进行定性或半定量分析。而荧光标记材料作为第二代标记材料，实现了对待测物的定量分析，相比于耗时久的生化检测方法及依赖大型仪器的质谱分析技术，更能满足日益增长的即时检测需求，早已成为快检产品开发的首选材料之一。相比于传统的胶体金免疫层析检测技术，荧光免疫层析具有更高的灵敏度和准确度，并且便于与小型化仪器结合，实现精确的定量分析。

AIE荧光微球是将AIE荧光分子包裹在聚苯乙烯微球中而制备的高性能标记材料，具有量子产率高、光稳定性好、抗光漂白能力强等特点。利用材料性能的优势，并将其转变成产品优势，AIE免疫层析产品具有高灵敏度、高准确性和高可靠性等特点。

以AIE标记材料开发的用于新冠病毒（SARS- CoV-2）抗体的免疫层析快速诊断方法，将AIE810nm分子包入聚苯乙烯微球中制成约300纳米的荧光微球，然后在表面修饰上病毒蛋白抗原，利用智能手机的摄像头就可看到其与血液样本反应后在试纸条上的特定位置显示出荧光条带[1]。与胶体金相比，AIE标记材料对病毒抗体IgM和IgG的检出限（即在样品中能检出的被测组分的最低浓度）更低，灵敏度也更高，能更早发现感染。

尿液中有许多可以反映疾病的成分，如尿微量白蛋白可用于早期慢性肾脏疾病的筛查，尿白细胞则可以反映身体局部有无感染或炎症的发生。一种基于尿液样本检测开发的使用AIE标记材料的即时检测方法[2]，利用尿微量白蛋白和白细胞疏水作用或静电作用激活AIE探针的荧光特性，只需20分钟左右，即可通过智能手机摄像装置观察到尿液中的尿微量白蛋白和白细胞。其原理是水分蒸发过程中，尿微量白蛋白扩散形成环形印迹，而白细胞大部分集中分布在中心区域，它们的分布显现出“咖啡环效应”。该方法可结合仪器对尿微量白蛋白和白细胞进行定量分析，实现早期慢性肾脏疾病的筛查。

化学发光产品

化学发光技术具有全自动化、高灵敏度、无须外界激发光源等优点，已广泛应用于生物检测领域。由于化学发光是超微弱发光，所以一般通过化学发光共振能量转移（chemiluminescence resonance energy transfer， CRET）来增强发光的强度，改变发射波长或者发光时间。荧光分子在吸收能量后，会跃迁到激发态，而被用作能量接受体。但传统有机荧光分子都具有聚集诱导猝灭效应，在高浓度下发光效率受到一定限制。

AIE材料被发现后，其在聚集状态的优异发光特点受到了广泛关注和研究。例如，研究人员通过将AIE荧光分子作为CRET受体，以化学发光体系“过氧草酸酯-过氧化氢”为能量供体，构建了高效的CRET体系[3]，并提出了一种阳离子AIE表面活性剂介导鲁米诺发光体系的策略[4]，构建了高强度、长寿命的辉光型化学发光体系。该体系通过制备具有AIE性质的阳离子表面活性剂分子C8-TPE-C4TAB，诱导鲁米诺发光体系产生高强度、长寿命的辉光（持续時间超过1小时）。其化学发光强度增敏主要源自两方面：一是胶束表面静电作用诱导反应物富集，提高反应效率；二是AIE荧光受体与激发态鲁米诺距离短，具有超高的CRET效率。而长寿命化学发光特性则主要是因为中性环境下极低的过氧化阴离子摩尔分数延长了化学反应时间，且AIE胶束增加了溶液黏度，有助于减慢扩散速度。

AIE材料的独特性质给化学发光产品带来了新的突破，给更高效、更稳定的化学发光产品奠定了基础，进而为未来的科技应用提供更多可能性。

分子检测产品

分子检测实验主要用于检测基因、蛋白质和其他生物分子的表达和功能，在生物医学研究中有重要作用。实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR， RT-qPCR）是指在PCR（polymerase chain reaction，聚合酶链式反应）体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板进行定量分析的方法。常用的定量PCR方法有染料法和探针法。

染料法（常用荧光染料SYBR GreenⅠ，这是一种具有绿色激发波长的染料） 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，该染料特异性地掺入DNA双链后发射荧光信号，而没有掺入链中的SYBR染料分子不会发射荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

探针法（常用TaqMan探针，这是一种荧光标记的水解探针） TaqMan探针具有“哑铃”型结构，其报告基团发射的荧光信号会被猝灭基团吸收；当发生PCR扩增时，Taq酶会将TaqMan探针酶切降解，使荧光报告基团和猝灭基团分离，荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成基本同步。

商业双链DNA（double stranded DNA， dsDNA）结合染料（如SYBR GreenⅠ）在自由状态下发光较弱，但插入dsDNA序列后发光增强。它们的发光强度随着DNA的指数扩增而定量增加。然而，短斯托克斯位移（<30纳米，斯托克斯位移是指荧光光谱较相应的吸收光谱红移的现象）使得吸收和发射光谱之间有很大的重叠，从而导致自吸收或内滤效应，降低了信噪比和检测灵敏度。与SYBR Green荧光染料相比，AIE荧光材料具有更大的斯托克斯位移（>100纳米），从而防止了光谱重叠或内滤效应以及聚集引起的猝灭，提高了灵敏度。

基于聚集诱导发光分子（AIEgen）的探针在核酸检测中有重要应用[5]。探针由两部分组成，产生荧光信号的AIE活性基团和与DNA结合的靶向基团。与SYBR Green类似，基于AIEgen的DNA探针在自由状态下发光较弱，但与dsDNA结合后发光增强。研究人员基于AIE原理，利用铱配合物开发了一种简单的单步荧光检测SARS-CoV-2 RNA的方法：巧妙设计的铱探针在有SARS-CoV-2 RNA的情况下“开启”荧光，并在室温下10分钟内给出准确结果，检测限低至1.84个基因拷贝[6]。研究人员还测试了20例临床样本，该方法的敏感度和特异度分别为90%和80%。

利用AIE材料的性能，分子检测可以实现更高的灵敏度，推动了技术水平的提升，也将为医学诊断等领域提供更加创新和可靠的解决方案。

免疫组织化学产品

免疫组织化学（immunohistochemistry， IHC）是利用抗原抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体（或抗原）的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色以确定组织、细胞内抗原（或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算其含量，以此对组织切片或细胞标本中的该抗原（或抗体）组分进行定位、定性或定量的一种原位检测技术。IHC能为研究人员提供目标物质在细胞和组织中的功能及分布，以及肿瘤等其他疾病的进行程度、药物疗效等信息。

研究人员[7]将具有AIE特性的分子作为发光基元与疏水基团和生物相容性好的亲水基团偶联，制成具有AIE特性的新型纳米粒子NDSA@SALL4，并在表面修饰上SALL4（一种调控胚胎腹部运动神经元发育的重要转录因子）蛋白抗体。该纳米粒子在水中发射较强的橙色荧光，当利用它对癌组织及匹配的癌旁组织标本进行免疫荧光染色，它可以特异性地靶向肝癌细胞及肝癌组织，并富集在细胞核中，发出明亮的橙黄色荧光。该方法对原发性肝癌组织免疫荧光染色的灵敏度和特异度优于IHC染色，为早期检测肝癌细胞提供了一种新方式。

聚集诱导发光材料由于荧光信号强度高且不易猝灭，还可以应用于多重免疫组织化学/免疫荧光（multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence， mIHC/IF），在检测低丰度样品时，可大幅提高检测灵敏度。mIHC在一张组织切片上最多可以对7个生物标志物进行免疫荧光染色，对组织内细胞的组成、定位、功能等信息进行定量评估，并对细胞间原位空间等信息进行全景式描绘。AIE材料助力mIHC技术，对患者肿瘤标志物的检测分析、肿瘤免疫分型、精准筛查等具有重要应用价值。

医药及光学诊疗领域中的应用

近年来，AIE材料亦在生物领域大放光彩，并取得了突破性进展。同时，AIE聚合物也有着优异的表现，如结构多样性、功能可调及优异的光动力/光热性能，使其在药物/基因递送、疾病治疗等应用中拥有良好的发展前景。

利用聚集诱导发光效应可以跟踪细胞内药物载体的动态轨迹。而荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer， FRET）可用于监测成像系统可视化动态过程，利用药物载体与药物之间的FRET效应可以研究载体在细胞内的释放过程[8]。研究人员研制出一种同时具有AIE效应和FRET效应的超分子药物载体HG/CD（负载抗癌药物阿霉素），进行药物载体的动态轨迹和药物释放过程的监测，研究结果表明该体系对癌症有良好的治疗作用[9]。

光动力治疗（photodynamic therapy， PDT）是利用特定波长的光激发光敏剂产生强氧化性的活性氧（reactive oxygen species， ROS），从而氧化破坏组織和细胞中的各类生物大分子，使病变部位的细胞发生不可逆损伤甚至死亡的一种新技术。光敏剂是PDT的关键，其ROS产生效率的高低直接影响PDT效果。不同于传统光敏剂，AIE聚合物不仅具有良好的光照敏化产生ROS的能力，并且光敏性能会随着聚集体的生成而不断增强，目前已经应用于诊疗一体化中。研究人员基于不同微生物细胞壁结构的差异，设计制备了一系列AIE聚合物。经细菌实验表明，该AIE聚合物具有良好的光敏化产生ROS的能力，并能高效杀灭所结合的微生物，且没有产生耐药性[10]。

AIE作为发光领域的“奇兵”，其自生的发光行为在很大程度上可以满足体外诊断领域的信号输出需求。不论是市场普遍需求的免疫层析产品，还是具有前沿创新的新型POCT产品、开拓性的化学发光增强剂、分子诊断探针，用于病理检测的免疫组化产品，以及可诊疗一体化的多功能产品，AIE都已凸显出了应用潜质，证明了其作为新材料发展核心驱动力的价值。当然，AIE材料作为底层技术的创新及发展，虽然获得了诸多实验室研究的认可，并且在商品化方面迈出了第一步，但是想要引领未来产业发展，还须克服许多市场化的困难。作为真正的“中国原创”科学理论和体系，AIE材料及技术未来的产业转化道路将持续创新，实现原创技术的高质量发展。

[1]Chen R， Ren C， Liu M， et al. Early detection of SARS-CoV-2 seroconversion in humans with aggregation-induced near-infrared emission nano-particle-labeled lateral flow immunoassay. ACS Nano， 2021， 15（5）： 8996-9004.

[2]Guan S， Fu Q， Wang D， et al. Point-of-care urinalysis with one drop of sample using an aggregation-induced emission luminogen under the coffee-ring effect. ACS Sensors， 2022， 7（11）： 3481-3490.

[3]呂超. 聚集诱导发光在化学发光共振能量转移中的应用. 中国化学会第十三届全国分析化学年会论文集（二），2018.

[4]Yu Y， Yuan Z， Lu C. Long-lasting chemiluminescence by aggregation-induced emission surfactant with ultralow critical micelle concentration. Aggregate， 2023： e349.

[5]Liu Z， Meng T， Tang X， et al. The promise of aggregation-induced emission luminogens for detecting COVID-19. Frontiers in Immunology， 2021， 12： 635558.

[6]Gupta A， Adarsh T， Manchanda V， et al. COVID-19 detection using AIE-active iridium complexes. Dalton Transactions， 2023， 52（5）： 1188-1192.

[7]邵玥明. SALL4在原发性肝癌中的表达及其纳米荧光检测体系的构建. 长春： 吉林大学， 2021.

[8]Yuan Y， Liu B. Visualization of drug delivery processes using AIEgens. Chemical Science， 2017， 8（4）： 2537-2546.

[9]Dong Z， Bi Y， Cui H， et al. AIE supramolecular assembly with FRET effect for visualizing drug delivery. ACS Applied Materials& Interfaces， 2019， 11（27）： 23840-23847.

[10]Qi G， Hu F， Kenry， et al. Bacterium-templated polymer for self‐selective ablation of multidrug-resistant bacteria. Advanced Functional Materials， 2020， 30（31）： 2001338.

关键词：聚集诱导发光 即时检测产品 化学发光检测产品分子检测产品 免疫组织化学产品 ■