UPLC-MS/MS 测定特殊医学用途配方乳粉中姜黄素类化合物

公丕学，戴琨，薛霞，徐大玮，赵寅，王骏，胡梅，张喜琦，刘艳明

（山东省食品药品检验研究院，国家市场监管重点实验室（肉及肉制品监管技术），产业技术基础公共服务平台，山东省特殊医学用途配方食品质量控制工程技术研究中心，济南 250101）

0 引 言

姜黄素是一种从姜科、天南星科等植物根茎中获取的一种二酮类天然化合物，是橙黄色晶体粉末，其味稍苦，不易溶于水[1]。姜黄素具有消炎、降血脂、抗癌、抗肿瘤、利胆、抗氧化、治疗耐药性结核病等作用[2-6]。姜黄素类化合物结构如图1 所示，含有β-二酮及酚基基团，存在3 种化合物分别是姜黄素（curcumin，CurI）、脱甲氧基姜黄素（demethoxycurcumin，CurII）、双脱甲氧基姜黄素（bidemethoxycurcumin，CurIII）[7]，3种姜黄素化合物结构相似，具有相似的生物活性，但由于结构上存在微小差异又使它们在抗肿瘤、抗氧化等方面的能力有较大差异[8]，3 种化合物的含量也不同，其中CurI 约为70%，CurII 约为10%～20%，而CurIII约为10%[9]。姜黄色素具有较好的热稳定性，但耐光性较差，室外光照会使乙醇溶液中的姜黄素类化合物降解[10]。食品中含少量的姜黄素，食用其对人体造成的不良反应较小，但过多食用含姜黄素过量的食品，也会造成一些不利影响，如对人体会造成接触性皮炎、起红疹、持续性瘙痒和灼痛；引起肠胃道反应，出现烧心和胃酸过多，导致反胃、呕吐或腹泻；可能加重结石病人、贫血患者、孕妇等特殊人群患病风险[11]。目前我国姜黄（以姜黄素计）作为着色剂在调制乳粉和调制奶油粉（包括调味粉和调味奶油粉）中使用最大限量为0.4 g/kg[12]，但在特殊医学用途配方乳粉中并未查到使用限量，有望作为功能成分在其中使用。

图1 姜黄素化合物结构式

目前文献报道的姜黄素检测方法主要有电化学法[13]、分光光度法（spectrophotometry，SP）[14]、薄层色谱法（thin-layer chromatography，TLC）[15]、毛细管电泳法（capillary electrophoresis，CE）[16]、化学发光法（chemiluminescence method，CL）[17]、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[18-20]、UPLC-MS/MS 法[21-26]，其中HPLC 应用最为广泛。检测方法主要针对生物检材、中成药居多，行业标准《出口食品中姜黄素的测定》是针对食品中姜黄素类化合物的检测[27]，检测范围包含调制乳粉，并没有关于特殊医学用途配方乳粉中姜黄素类化合物含量的测定。特殊医学用途配方乳粉是适应对母乳和普通奶粉过敏（主要是对牛奶蛋白，如β-乳球蛋白过敏）的孩子，当然常见的婴儿特殊医学状况也包括乳蛋白过敏、乳糖不耐受、早产/低体重、苯丙酮尿症、营养不良等。其中根据病患情况需要特殊添加某些成分，比如不同水解程度的氨基酸、还有氯化胆碱、矿物质及维生素等多种成份，这些非目标物就成为分析时的干扰物质，在实验过程中需要尽量降低干扰物的影响[28-29]。本研究针对特殊医学用途配方乳粉样品基质复杂、蛋白含量高等特点，选择通过式固相萃取净化方式，优化实验方法，结合超高效液相色谱串联质谱的定性定量准确的优点，建立UPLC-MS/MS 法测定特殊医学用途配方乳粉中姜黄素含量。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

ACQUITY UPLC，美国Waters 公司；SCIEX Triple Quad 5500 三重四极杆质谱仪配有电喷雾离子源（ESI）及MultiQuant 数据处理系统，美国SCIEX 公司；UMV-2 多通道漩涡混合器，山东青云实验耗材有限公司；3-18K 离心机，德国Sigma 公司；恒温氮吹浓缩仪，美国Organomation 公司。

甲醇、乙腈均为色谱纯，德国Merck 公司；甲酸（Formic acid，FA）、氨水（Ammonium hydroxide，AH）、乙酸铵（Ammonium acetate，AA）均为色谱纯，美国Fisher 公司；CurI（CAS 号：458-37-7，纯度≥98%）、CurII（CAS 号：22608-11-3，纯度≥98%）、CurIII（CAS号：33171-05-0，纯度≥98%），德国Dr.Ehrenstorfer 公司；实验用特殊用途配方乳粉，市售。

固相萃取柱C18（200 mg/6 mL）、HLB（200 mg/6 mL）、Oasis PRiME HLB （200 mg/6 mL），美国Waters 公司；色谱柱ACQUITY UPLC HSS T3、色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18、色谱柱ACQUITY UPLC BEH Shield RP18，Waters 公司。

1.2 标准溶液配制

标准溶液配制：分别将3 种姜黄素标准品准确称取10 mg（精确至0.1 mg）于小烧杯中，先用甲醇溶解，然后转移到10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，获得浓度均为1 mg/mL CurI、CurII 和CurIII 的标准溶液。在-18 ℃避光保存6 个月。

标准工作溶液的配制：准确移取一定量的标准储备溶液，用空白基质配成系列标准工作溶液，质量浓度分别为25、62.5、125、250、625、1 250、2 500 ng/mL，冷冻避光保存，有效期1 个月。

1.3 样品预处理方法

提取样品：称取2.5 g 样品放置到50 mL 的离心管中，向离心管中加10 mL 80%乙腈，在多通道涡旋混匀器上混匀1 min，在超声波清洗机中超声20 min后，在离心机上以8 000 r/min 的转速高速离心5 min后，将离心管中的上清液取出待净化。

净化样品：取待净化上清液5 mL，直接过Oasis PRiME HLB 固相萃取柱，收集流出液，用10 mL 乙腈进行洗脱，收集所有流出液，50 ℃氮气流缓慢吹至近干，用10 mL 含0.1%甲酸的乙腈溶液（V乙腈∶V0.1%甲酸=45∶55）定容，涡旋1 min，超声5 min，过0.22 μm 混合纤维素膜，待上机。

1.4 试验条件

1.4.1 色谱条件

HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；样品室温度：15 ℃；色谱柱温度：35 ℃；进样量：2 μL；流速：0.3 mL/min。流动相条件如表1 所示。

表1 洗脱条件

1.4.2 质谱条件

电喷雾离子源；正离子扫描；多反应监测；雾化气温度：450 ℃；喷雾电压：5 500 v；雾化气压力：206 843 Pa；辅助气压力：206 843 Pa；碰撞气压力：55 158 Pa；3 种姜黄素化合物具体质谱参数如表2 所示。

表2 3 种姜黄素MRM 质谱参数

1.5 数据分析

通过Multi Quant 数据处理系统进行采集数据的处理，并采用Origin 进行绘图及数据分析。

2 结果与讨论

2.1 稳定性研究

姜黄素类化合物溶液在不同pH 值溶液中稳定性直接影响提取实验效果和定量结果的准确性，分别将标准溶液调节pH 值至1、3、5、7、9、11 后，考察3 种姜黄素在不同pH 值下稳定性，实验结果如图2 所示。当pH 值＜5 时，3 种姜黄素类化合物含量逐渐升高，当pH 值=5 时，达到最高，pH 值＞5 时，3 种姜黄素类化合物含量迅速降低，当pH 值继续增大到11 时，CurI和CurII 几乎看不到色谱峰。结合姜黄素类化合物结构进行推测分析，可能因为结构中含有邻甲氧基苯酚的邻位效应，酸性强于苯酚，因此在酸性环境下，3 种化合物的结构比在碱性条件下更稳定。随着pH 值升高，3 种化合物降解的反应速率符合一级动力学方程，降解速率明显加快。当溶液pH 值＞9 时，实验结果显示姜黄素类化合物的稳定性为CurIII＞CurII＞CurI，通过观察溶液颜色由黄色变为红色。根据结构分析可能是因为苯环上含有羟基和甲氧基，其电子密度较高，增加了亲电反应发生的概率。但苯环上没有这些基团后，其给电子的能力降低，电子密度随之降低，碳链上发生亲电反应的活性降低，才导致颜色发生转变。

图2 pH 值对3 种姜黄素稳定性的影响

2.2 样品处理条件优化

2.2.1 提取溶剂的优化

姜黄素类化合物的结构中含有酚羟基，微溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂和酸碱溶液中。酸碱溶液能导致其结构发生变化，因此选择甲醇、乙醇和乙腈3 种有机溶剂进行提取实验，由于特殊医学用途配方乳粉中含对检测有影响的蛋白质、脂肪等物质，乙腈比甲醇和乙醇提取液更澄清，提取效率高。选择20%、40%、60%、80%和100%乙腈不同比例进行提取实验，结果见图3 所示，随着乙腈比例增加，3 种化合物的提取效率也逐渐提高，但当达到100%时回收率反而降低，当乙腈比例低于80%时，回收率不高，可能是因为样品中干扰物因为水相比例过高导致沉淀不完全，干扰测定结果，当乙腈比例为100%时，乙腈的加入可能导致蛋白质立即变性，在样品表面形成沉淀层，阻止提取剂进入内部，导致目标物无法被完全提取，提取回收率低。因此选择80%乙腈作为实验提取溶剂。

图3 乙腈比例对3 种姜黄素提取效率的影响

2.2.2 净化方式的选择

在质谱分析中，特殊医学用途配方乳粉中蛋白质、脂肪等干扰物可能与目标物在喷雾液滴表面发生离子化竞争，在竞争时能够增强或减弱离子化效率和强度，干扰检测结果的准确性，选择合适的净化方式除去干扰组分。实验比较了QuEChERS、C18固相萃取柱、HLB 固相萃取柱和PRiME HLB 固相萃取柱4 种净化方式，结果如图4 所示，3 种姜黄素化合物通过PRiME HLB 固相萃取柱回收率最好，其他3 种净化方式回收率较低，因此样品净化选择PRiME HLB。

图4 不同净化方式对3 种姜黄素的影响

2.2.3 洗脱体积的优化

Oasis PRiME HLB 固相萃取柱无需活化、淋洗和洗脱，操作简便。实验中发现，若不进行洗脱，柱中还有残留的姜黄素类化合物，导致回收率偏低。因此实验选择1、2、5、8、10、12 mL 乙腈进行洗脱，实验结果如图5 所示，随着洗脱体积增大，洗脱回收率逐渐提高，当达到10 mL 时，回收率到90%以上，能够将目标物洗脱完全，因此选择洗脱体积为10 mL。

图5 洗脱体积对3 种姜黄素的影响

2.2.4 滤膜的选择

实验发现不同材质的滤膜对姜黄素类化合物有吸附，考察混合纤维素（MCM）膜、聚四氟乙烯膜（PTFE）、尼龙膜（Nylon）和聚醚砜（PES）膜四种滤膜对姜黄素类化合物的影响，结果如图6 所示，发现Nylon 膜和PES 膜对CurIII 有很强的吸附，回收率低。聚四氟乙烯膜对CurIII 也有一定吸附作用，可能是因为姜黄素类化合物分子与滤膜表面产生范德华力相互作用，从而使微滤膜对姜黄素类化合物产生了吸附作用。混合纤维素膜对3 种化合物回收率稳定，定量结果准确，过滤效果好，选用混合纤维素膜对样品处理液进行过滤。

图6 滤膜对3 种姜黄素化合物的影响

2.3 色谱条件的优化

2.3.1 色谱柱的选择

通过分子结构分析，CurI、CurII 和CurIII 都属于非极性化合物，能够在反相色谱柱上保留。姜黄素有3种同系物，需要选择适宜的色谱柱进行分离分析，实验选择并比较了ACQUITY UPLC HSS T3，ACQUITY UPLC BEH C18，ACQUITY UPLC BEH Shield RP183种类型色谱柱，实验结果如图7 所示，姜黄素类化合物在BEH C18和BEH Shield RP18色谱柱上存在拖尾现象，不能准确定量。在HSS T3色谱柱上3 种姜黄素化合物峰形对称，达到基线分离，能够准确用于定量。因此实验选择ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱作为分离姜黄素类化合物的分析柱。

图7 3 种姜黄素在不同色谱柱上分离色谱

2.3.2 流动相的优化

姜黄素类分子结构中含有羟基，而且存在共同的共轭苯环结构，能够吸电子，因此氢氧键上的电子偏向氧端，使得氢很容易解离，因此不同的流动相，会影响目标物的色谱分离效果，并造成响应值的变化。实验比较了乙腈-10 mmol/L 乙酸铵（10 mmol/L AA）、乙腈-10 mmol/L 含0.1%甲酸的乙酸铵（AA contain 0.1%FA）、乙腈-水、乙腈-0.1%氨水溶液（0.1%AH）、乙腈-0.1%甲酸溶液（0.1%FA）5 种不同流动相条件，实验结果如图8 所示，当流动相中含有乙酸铵时，峰面积响应降低，可能由于乙酸铵抑制了姜黄素类化合物的离子化所造成的；当流动相为乙腈-0.1%氨水时，化合物保留时间减小，色谱峰分离度低，峰形很差；当流动相为乙腈-水时，色谱峰产生拖尾，加入0.1%甲酸后，色谱峰形得到改善，推测是因为甲酸溶液提供了氢离子，提高了姜黄素类化合物离子化效率。将选择乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相，用于下一步分析实验。

图8 3 种姜黄素在不同流动相中分离色谱

2.4 质谱条件的优化

目标化合物在进入质谱后，形成[M+H]+的准分子离子峰，因此选择使用正离子电离模式。将50 ng/mL 的姜黄素混合溶液注入质谱仪，在电喷雾正离子模式下同时对3 种化合物做母离子扫描，选择不产生干扰且其对应的准分子离子峰丰度达到最大时，得到CurI、CurII 和CurIII 母离子质核比分别为369、339 和309；优化相关质谱仪器参数，选择无干扰且丰度较高的子离子，将离子丰度高的子离子369＞177.2、339＞147.3和309＞147.1 作为定量离子，以丰度相对低的子离子作为辅助定性离子，具体优化结果见表2 所示。

2.5 方法学评价

2.5.1 线性范围和检出限

将质量浓度分别为25、62.5、125、250、625、1 250、2 500 ng/mL 的混合基质标准工作液注入UPLCMS/MS，以定量离子的色谱峰峰面积（y）为纵坐标，混合基质标准溶液质量浓度（x）作为横坐标，绘制得到标准曲线及线性结果，如表3 所示。

2.5.2 回收率和精密度

选用特殊医学用途配方乳粉空白试样进行回收率和精密度试验，添加目标物的质量浓度分别为25、250、1 000 μg/kg 3 个不同水平分别做6 平行进行测定，加标样品计算结果见表4 所示。可见姜黄素类化合物加标水平在25～1 000 μg/kg 时的回收率在87.9%～102.8%之间，精密度RSD 为1.31%～4.94%。

表4 目标物回收率和精密度（n=6）

3 结 论

本研究使用非选择性固相萃取前处理净化技术，从目标物稳定性、提取和净化不同影响因素分别进行研究，结合高灵敏的超高效液相色谱串联质谱仪，建立了适合特殊医学用途配方乳粉中姜黄素类化合物的快速定性定量检测方法。目前，对特殊医学用途配方乳粉中姜黄素类化合物含量的测定的相关方法研究较少，本方法采用的是超高效液相色谱-质谱法检测特殊医学用途配方乳粉中姜黄素类化合物的含量，同时针对特殊医学用途配方乳粉蛋白含量高的特点，利用通过式固相萃取法快速净化样品提取液，去除蛋白质等干扰组分，并优化了实验方法。前处理方法简单快速、灵敏度高、准确性好，能够在宽质量浓度范围内准确对特殊医学用途配方乳粉中姜黄素类化合物进行定性及定量，同时为监管部门提供技术支持和数据积累。