马乳源性生物活性肽生物学信息及其抗肺癌作用靶点探索

古丽巴哈尔·卡吾力，马建宝，卡丽比努尔·艾尔肯，徐志伟，高晓黎

（新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830000）

0 引 言

肺癌是全球最常见、死亡率最高的恶性肿瘤，据国家癌症中心统计，肺癌在我国所有肿瘤中发病率和死亡率均居首位，每年约有82.8 万人发病、65.7 万人死亡，且呈持续增长趋势，肺癌防治已成为恶性肿瘤防控中面临的重点难点[1-3]。目前非小细胞性肺癌（NSCLC）的治疗手段包括手术、放疗、化疗、辅助化疗、靶向治疗、免疫治疗和姑息治疗，但因大多数患者在确诊时已是IIIB/IV 期，错过了最佳治疗机会，治疗效果及患者生活质量均较差，5 年总生存率仍低于20%[4]。探究NSCLC 的进展机制、发现潜在干预靶点和开发新药或新疗法对提高患者生存率和改善预后已迫在眉睫[4-5]。

癌症生物疗法通过启动宿主的防御机制和使用生物制剂来刺激机体的抗肿瘤生物反应，已在临床试验研究中进行研究，并在临床上应用，其中抗癌多肽类药物由于其生物相容性好、高效安全、更具耐受性和兼具生物免疫调节剂功能，在抗肿瘤治疗中展现出巨大潜力[6-8]。本研究组在前期工作中一直关注乳源性生物活性肽的分离纯化及其活性研究，并发现了具有抗氧化和抗肺癌细胞增殖并诱导其凋亡的鲜马乳源性生物活性肽（VAPFPQPVVPYPQR，相对分子质量为1 594.88 u，纯度≥95%）[9]，但其抗肺癌的具体作用机制尚不清楚。因此本研究对马乳源性生物活性肽在NSCLC 治疗中的作用及机制进行探索，以期为开发新抗癌多肽药物提供理论依据和实验证据，对改善肺癌患者治疗效果和提高生存率具有重要的潜在意义。

1 数据来源与方法

1.1 马乳来源活性肽生物学信息测定

用https://web.expasy.org 网站ProtParam 工具分析理化性质，用http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html 软件中的SOPMA 工具对其二级结构预测, 用https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? 网站中的Signal5.0 对其进行信号肽预测,用https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? 网站中的TMHMM-2.0 软件对其跨膜区进行预测,用http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#网站WoLF PSORT软件进行亚细胞定位[10-14],用https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? 网站中NetPhos-3.1 软件对其进行磷酸化分析,用软件https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?网站NetOGlyc-4.0 对其进行糖基化位点预测,用http://web.expasy.org/protscale/网站的ProtScale 工具分析疏水性,用ToxinPred http: // www. imtech. res. in/ raghava / toxinpred / AlgPred 预测其毒性[15-16]。

1.2 肺癌靶点的富集及关键靶蛋白筛选

通过OMIM 数据库（https://omim.org/）获取肺癌疾病相关靶点，并对获取的靶点进行整理去重，进一步使用Metascape 数据库（https://metascape.org/gp/index.htm）对疾病靶点进行GO 功能富集分析和KEGG通路富集分析，并从中筛选出与肺癌关联度较高的通路蛋白[17-18]。

1.3 肺癌关键蛋白与马乳抗氧化活性肽分子对接

使用PDB 蛋白数据库（https://www.rcsb.org/）搜索靶蛋白，下载PDB 格式的2D 结构文件。使用PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）搜索氨基酸，下载sdf 格式的2D 结构文件[19]。通过ChemDraw 20.0 软件将氨基酸活性肽段连接成多肽序列并使用Chem3D 20.0 软件获得多肽的3D 结构文件，选择最低能量构象并保存为mol 格式文件。

采用AutoDock 1.5.6 软件包对靶蛋白及多肽进行加氢、计算电荷、调整电荷等操作，前处理后保存相关格式文件，使用AutoDock vina 进行分子对接，算法中所有参数均为默认值，每组对接选取结合能最小的结果，使用Pymol 软件绘制分子对接结果图[20-23]。

2 结果与讨论

2.1 马乳源性活性肽生物信息

2.1.1 马乳源活性肽的理化性质

马乳源性活性肽（VAPFPQPVVPYPQR）的分子式为C77H115N19O18，原子数229，有14 个氨基酸残基，由7 种基本氨基酸组成，其中占比较高的谷氨酸被人体吸收后，易与血氨形成谷氨酰氨，能解除代谢过程中氨的毒害作用，因而能预防和治疗肝昏迷，保护肝脏，是肝脏疾病患者的辅助药物。另一种占比较高的缬氨酸具有氧化供能、促进蛋白合成、抑制蛋白降解、促进糖异生等生理功能，在生物应用中发挥重要作用，当缬氨酸不足时，中枢神经系统功能会发生紊乱，共济失调、四肢震颤，由于多肽包含关键氨基酸，为其今后的研究提供依据。

马乳源性多肽分子质量较小，大约为1 594.88 u，免疫原性较低，氨基酸组成结果如表1 所示。马乳源性多肽等电点为8.72，带负电的残基(Asp+Glu)数为0个，带正电荷的残基(Arg+Lys)数为1 个，在280 nm 处可测其吸光值。其半衰期在哺乳动物细胞（体外）中为100 h，在酵母(体内)中＞20 h，在大肠杆菌(体内)中＞10 h ，不稳定指数为128.16，脂溶性指数(aliphatic index)为69.29，亲水性总平均值（GRAVY）值为-0.257，马乳源性生物活性肽为带正电荷的弱碱性小分子肽，且为不稳定的亲水性蛋白多肽，这些性质在考察多肽溶解行为、分离纯化、靶向给药提供有力的数据支撑。除此之外，带正电荷的多肽有利于与带负电荷的细菌细胞膜通过静电作用结合在一起，从而产生一定的生物活性。

表1 马乳源性活性肽氨基酸组成

2.1.2 马乳源性活性肽二级结构

二级结构在发挥多肽生物活性中起关键作用，LV Y 等[24]对猪源抗菌肽PMAP - 36 的结构、抗菌活性及作用机理进行了研究,结果表明PMAP -3 的α-螺旋区为与细菌细胞膜相互作用的区域。研究通过软件分析 (检测参数：Window width 为17，Similarity threshold 8,Number of states 为4)，马乳源性活性肽二级结构均为无规则卷曲(14 个氨基酸残基全部参与)，如图1 所示，使用RPBS Webpo ratl（mobyle.rpbs.univ-paris-diderot.fr/cgi-bin/portal）网站工具与Chem Draw 20.0 软件预测及绘制的马乳源性活性肽的3D结构图，如图2 所示。

图1 马乳源性活性肽二级结构预测

图2 马乳源性活性肽3D 结构预测

2.1.3 马乳源性活性肽跨膜区预测

亚细胞定位即某种蛋白或某个基因表达产物在细胞内的存在部位,有助于蛋白质功能的初步判断。通过软件分析发现，马乳源性活性没有跨膜区，均在细胞外，因此推断马乳源性活性肽可能在细胞外发挥生物学活性，结果如图3 所示。

图3 马乳源性活性肽跨膜区预测

2.1.4 马乳源性活性肽信号肽预测

信号肽是分泌蛋白上的一段富含疏水性氨基酸的肽段，用于指导蛋白质的跨膜运输。经过软件分析，马乳源性活性肽没有信号肽，进一步说明这个氨基酸残基并不是分泌蛋白产生的，它是由游离的核糖体合成，进入胞质溶胶的蛋白质，参与线粒体、细胞核、过氧化物酶体等的化学反应，结果如图4 所示。

图4 马乳源性活性肽信号肽预测结果

2.1.5 马乳源性活性肽的糖基化和磷酸化位点预测

蛋白质糖基化对其功能具有重要影响, 不仅影响蛋白质的空间构象、活性、运输和定位，而且在信号转导、分子识别、免疫等过程中发挥重要作用。经软件分析，马乳源性活性肽糖基化位点低于0.5，推测其不存在糖基化位点。

蛋白质磷酸化是生物界最普遍、研究最为深入的一种蛋白翻译后修饰, 在生物的整个生命活动中发挥着重要的调节作用，通过软件分析，马乳源性活性肽没有磷酸化位点，无法被多种激酶磷酸化。

2.1.6 马乳源性活性肽毒性和活性预测

相比于小分子药物，多肽主要通过水解和肾过滤来清除，水解的产物为氨基酸，因此多肽药物的代谢产物毒性很低；其次多肽类药物往往以内源性多肽为模板进行特异性设计，通常具有较高的靶标亲和力。虽然马乳源性多肽是外源性多肽，但是经过软件分析，马乳源性活性肽无毒性，将氨基酸序列输入BIOPEP数据库（https://biochemia.uwm. edu.pl/biopep-uwm/）搜索是否有相匹配的已知功能肽段，结果并未搜索到相匹配的肽段，毒性预测结果如图5 所示。

图5 马乳源性活性肽毒性预测

2.2 马乳源性多肽生物活性预测

前期研究发现，马乳源性活性肽可抑制肺癌A549细胞增殖，使其在G1 期阻滞和增加细胞凋亡，但其具体机制尚不得知。基于上述，本文为了筛选马乳源性活性肽的抗肺癌潜在靶蛋白，进行了通路富集分析，并筛选出与肺癌高度关联的通路中的可能靶蛋白，进行了分子对接，为其进一步研究生物学功能提供了理论基础。

2.2.1 肺癌靶点的GO、KEGG 富集分析

通过对OMIM 数据库获取肺癌疾病相关靶点进行整理去重，得到515 个靶点蛋白，利用Metascape 数据库就行肺癌靶点的GO、KEGG 富集分析，肺癌靶点GO 生物过程（BP) 主要包括DNA 代谢过程(DNA metabolic process)、细胞增殖的负调控(negative regulation of cell population proliferation)、细胞周期相变的调节(regulation of cell cycle phase transition)等，GO 细胞成分（CC) 则包括错配修复复合体(mismatch repair complex)、染色体区(chromosomal region)、等离子膜筏(plasma membrane raft)等；而GO 分子功能（MF) 包含ATP 依赖性DNA 损伤传感器活性（ATP-dependent DNA damage sensor activity）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）、跨膜受体蛋白激酶活性（transmembrane receptor protein kinase activity）等；KEGG 通路富集分析结果显示，关键通路富集为癌症的途径（Pathways in cancer）、DNA 修复疾病（Diseases of DNA repair）、综合癌症途径（Integrated cancer pathway）、细胞增殖的负调控（negative regulation of cell population proliferation）、细胞周期相变的调节（regulation of cell cycle phase transition）等，表明以上过程、通路等是肺癌治疗的关键，结果如图6～7 所示。

图6 肺癌靶点的GO 富集分析

图7 肺癌靶点的KEGG 富集分析

2.2.2 靶蛋白筛选结果

通过富集结果，进一步筛选出与肺癌关联度高的通路如肺上皮发育（lung epithelium developmen）、肺叶发育（lung lobe development）、肺叶形态发生（lung lobe morphogenesis）、肺泡发育（lung alveolus development）等通路的靶点蛋白，并筛选出在这些通路中出现频率大于5 次的靶点蛋白，分别为钙黏蛋白相关蛋白(cadherinassociated protein beta 1，CTNNB1)、成纤维细胞生长因子受体2(broblast growth factor receptor 2，FGFR2)、叉头盒转录基因F1 (forkhead box-F1，FOXF1)、鼠肉瘤基因(Kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS) 、甲状腺转录因子-1 (NK2 homeobox 1，NKX2-1）、转化生长因子Ⅱ型受体（ecombinant Transforming Growth Factor Beta Receptor II ，TGFBR2）等作为对接靶蛋白。

2.2.3 马乳源活性肽与靶蛋白对接结果

如表2 所示，马乳源活性肽与6 种靶点蛋白进行分子对接后，结合能均小于-20 kJ/mol，表明此肽段与CTNNB1、FGFR2 、FOXF1 、KRAS、NKX2、TGFBR2等蛋白均能进行有效的结合，通过Pymol 软件构建马乳源活性肽与各靶点蛋白的3D 结合模型如图9～14所示，马乳源活性肽与CTNNB1 蛋白的（ARG-185、HIS-219、HIS-223、LYS-292）、FGFR2 蛋白的（PRO-486、ACP-300、ARG-579、GLU-604、GLU-574、LEU-753、ILE-548、MET-540）、FOXF1 蛋白的（SER-273、SER-275、SER-72、TYR-75、GLN-90、LYS-93、ARG-97）、KRAS 蛋白的(THR-74、GLN-70、ALA-59、MET-67、GLU-63、ARG-688、ASP-762、ASN-760、VAL-691、ASN-697、MET-698）、NKX2 蛋白的（LYS-163、ARG-165、TRP-371、TYR-367、ASN-211、TRP-208）、TGFBR2 蛋白的（GLU-59、ASP-80、CYS-78、HIS-86、ASP-87、GLU-108、ASN-68、ARG-66）等位点的氨基酸残基形成氢键，从而与各靶点蛋白间产生有效且强的结合力，可能是马乳源性活性肽抗肺癌的关键靶点。这也表明马乳源活性肽对肺癌的治疗中能起到一定的作用，是具有抗肺癌作用的活性成分。

图9 马乳源活性肽与靶蛋白CTNNB1 的结合位点

图10 马乳源活性肽与靶蛋白FGFR2 的结合位点

图11 马乳源活性肽与靶蛋白FOXF1 的结合位点

图12 马乳源活性肽与靶蛋白KRAS 的结合位点

图13 马乳源活性肽与靶蛋白NKX2 的结合位点

图14 马乳源活性肽与靶蛋白TGFBR2 的结合位点

表2 马乳源活性肽与靶蛋白相互作用结果

3 结 论

通过对鲜马乳乳源性生物活性肽（VAPFPQPVVPYPQR）的理化性质进行分析，结果显示，该多肽二级结构均由无规则卷曲构成，为不稳定的亲水性蛋白多肽、带正电荷、没有跨膜区和信号肽且定位于细胞外的多肽，无糖基化位点和磷酸化位点，且经数据库查询分析其不具有毒性。

基于上述，筛选了马乳源性活性肽的抗肺癌潜在靶蛋白，进行了通路富集分析，并筛选出与肺癌高度关联的通路中的可能靶蛋白，如钙黏蛋白相关蛋白（CTNNB1）、成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2）、叉头盒转录基因F1（FOXF1）、鼠肉瘤基因（KRAS）、甲状腺转录因子-1（NK2 homeobox 1，NKX2-1）、转化生长因子Ⅱ型受体（TGFBR2）等。进一步通过分子对接得出此活性肽与肺癌相关蛋白CTNNB1、FGFR2、FOXF1、KRAS、NKX2、TGFBR2 等蛋白均能进行有效的结合，可能是马乳源性BAP 抗肺癌的下游靶点。

虽然利用生物信息学方法可大大降低多肽的筛选或预测成本,且能得到较为满意的结果,但仍需进行后续试验来验证。本研究为深入研究乳源性活性肽的功能、构效关系及作用机制提供了理论基础，同时为新型多肽的设计改造提供了思路。