芪地糖肾颗粒对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗、脂代谢及AdipoR1、AMPK蛋白的影响

张 颖,靳亦龙,周立新

(1.衡水市人民医院内分泌科,河北 衡水 053000;2.衡水市第四医院,河北 衡水 053000)

2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)作为临床中较常见的一类代谢紊乱型疾病具有较高的发病率,而胰岛素抵抗不仅是影响T2DM进程的重要因素,也是引起本病中脂代谢紊乱的关键诱因[1-2]。T2DM在临床中常表现为代谢紊乱,而胰岛素抵抗可与这类现象相互影响并产生恶性循环[3]。经研究,脂联素通过与其受体结合可发挥多种生物学作用,而骨骼肌脂联素受体1(Adiponectin receptor1,AdipoR1)作为其重要受体亚型之一,与脂联素结合后可通过激活腺苷酸激活蛋白激酶蛋白(AMP-activated protein kinase,AMPK)调节肾小管间质p38激活丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-actvated protein kinase,p38MAPK)及葡萄糖代谢水平,进而参与疾病中脂肪酸氧化反应[4-5]。近年来,随着中医药在疾病研究中的不断深入,发现部分中药在糖尿病中具有改善胰岛素抵抗的潜能。因此,临床中可以此作为切入点研制相关治疗T2DM的相关药物。中医理论认为,糖尿病的病因在于阴虚气滞、肾瘀精阻,而芪地糖肾颗粒作为中成药是以明代张景岳提出的“真阴精气”理论加以补肾填精为主要治疗原则的方剂[6]。该方主要以熟地、生黄芪、芡实、山萸肉、水蛭、熟大黄、白花蛇舌草等多种成分组合而成。有学者研究发现,该方不仅可有效降低糖尿病患者蛋白尿水平,还在降低血糖及预防糖尿病肾病等方面具有一定疗效[7-8]。本文通过探究芪地糖肾颗粒对T2DM胰岛素抵抗、脂代谢及AdipoR1、AMPK等相关蛋白的作用机制,为该药在相关疾病的临床治疗中提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF清洁级雄性Wistar大鼠50只,6～8周龄,体重160～220 g,购于北京维通利华动物技术有限公司,许可证号SCXK(京) 2018-0006,于我院动物实验中心进行饲养,湿度50%～60%,温度16～22 ℃,昼夜交替,自由进食饮水,本次动物实验均严格按照我院动物伦理原则操作。

1.2 药物与试剂 芪地糖肾颗粒(涿州东乐制药公司,国药准字Z20113036);胰岛素放免试剂盒(北京科美东雅生物技术有限公司,批号：080829);蛋白检测试剂盒(美国Sigma公司,批号：201208);ELISA试剂盒(美国R&D公司,批号：201211);p38MAPK、AMPK、AdipoR1抗体(深圳市豪地华拓生物科技有限公司,货号PL0305436、PL0502571、252007)。

1.3 实验仪器 全自动生化分析仪(日本奥林巴斯公司,型号：AV5421);台式离心机(武汉爱斯佩有限公司,型号：DM041 Ⅱ);全自动生化分析仪(深圳迈瑞有限公司,型号：BS-200)。

1.4 实验方法 依据随机数字表法将大鼠分为健康组、模型组及低、中、高剂量组。除健康组外其余组均参照文献[9]建立糖尿病模型,高脂高糖喂养1周后腹腔注射2%链脲霉素25 mg/kg,取尾静脉血测血糖>16.67 mmol/L为建模成功。健康组与模型组大鼠均1次/d给予等量0.9%氯化钠溶液进行灌胃;芪地糖肾颗粒各剂量组给药依据文献[10]按中药出药率28.16%计算,人用药量为26.2 g,用羧甲基纤维素液配制成浓度为低剂量1.31 g/kg、中剂量2.62 g/kg、高剂量5.24 g/kg的药液,均于每日上午9：00前预热30 min后灌胃1次,连续干预30 d。

1.5 观察指标

1.5.1 ELISA检测大鼠血清中脂质代谢水平：给药结束后禁食24 h,麻醉抽取腹部静脉血1 ml,2000 r/min离心20 min,检测总胆固醇(Total cholesterol,TC),高密度脂蛋白胆固醇(High density lipoprotein cholesterol,HDL-C),低密度脂蛋白胆固醇(Low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C),甘油三酯(Triglyceride,TG)表达,操作步骤严格按照说明书标准进行测定。

1.5.2 酶联免疫法测定胰岛素抵抗：大鼠禁食12 h,用戊巴比妥钠麻醉后,腹主动脉取血,放免法评估空腹胰岛素(FINS),酶联免疫法评估空腹血糖(FBG),依据文献[11-12]以FBG与FINS乘积倒数的自然对数来表示,计算胰岛素敏感性指数(ISI)=Ln[1/(FINS×FBG)]和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=(FBG×FINS)/22.5。

1.5.3 免疫印迹检测AdipoR1、AMPK、p38MAPK：用2%戊巴比妥10 ml/kg麻醉处死大鼠,取50 mg骨骼肌组织,提取总蛋白试剂盒检测浓度,电泳后将蛋白分离,转PVDF膜,密封2 h,加抗体AdipoR1(1∶500)、AMPK(1∶500)、p38MAPK(1∶1000),4 ℃孵育24 h,洗涤,加二抗(1∶500), β-actin为内参,Image J软件测得灰度值。

1.5.4 PCR检测AdipoR1、AMPK、p38MAPK mRNA：大鼠全身麻醉后取骨骼肌组织50 mg,液氮研磨,按TRIzol说明书提取并测定总RNA,合成cDNA,取2 μl cDNA行PCR反应,反应体系25 μl,反应条件：95 ℃,5 min预变性,90 ℃,15 s变性,70 ℃,30 s退火,75 ℃延伸30 s,共计40个循环,反应产物行琼脂糖凝胶电泳分析,引物序列由上海生物工程公司合成,用Image MasterTMTotal La图像分析系统分析基因表达量,见表1。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清中TC、HDL-C、LDL-C、TG表达比较 见表2。与健康组比较,模型组血清HDL-C降低,LDL-C、TC、TG均升高(P<0.05);与模型组比较,低剂量组血清HDL-C升高,LDL-C、TC、TG均降低(P<0.05);与低剂量组比较,中剂量组血清HDL-C升高,LDL-C、TC、TG均降低(P<0.05);与中剂量组比较,高剂量组血清HDL-C升高,LDL-C、TC、TG均降低(P<0.05)。

表2 各组大鼠血清中TC、HDL-C、TG、LDL-C表达比较(mmol/L)

2.2 各组大鼠血清中FBC、FINS表达比较 见表3。与健康组比较,模型组血清中FBC、FINS均升高(P<0.05);与模型组比较,低剂量组血清FBC、FINS均降低(P<0.05);与低剂量组比较,中剂量组血清FBC、FINS均降低(P<0.05);与中剂量组比较,高剂量组血清FBC、FINS均降低(P<0.05)。

表3 各组大鼠血清中FBC、FINS表达比较

2.3 各组大鼠HOMA-IR、ISI表达比较 见表4。与健康组比较,模型组ISI降低,HOMA-IR升高(P<0.05);与模型组比较,低剂量组ISI升高,HOMA-IR降低(P<0.05);与低剂量组比较,中剂量组ISI升高,HOMA-IR降低(P<0.05);与中剂量组比较,高剂量组ISI升高,HOMA-IR降低(P<0.05)。

表4 各组大鼠HOMA-IR、ISI表达比较

2.4 各组大鼠AdipoR1、AMPK、p38MAPK蛋白比较 见表5(图1)。与健康组比较,模型组大鼠AdipoR1、AMPK、p38MAPK蛋白均降低(P<0.05);与模型组比较,低剂量组大鼠AdipoR1、AMPK、p38MAPK蛋白均升高(P<0.05);与低剂量组比较,中剂量组大鼠AdipoR1、AMPK、p38MAPK蛋白均升高(P<0.05);与中剂量组比较,高剂量组大鼠AdipoR1、AMPK、p38MAPK蛋白均升高(P<0.05)。

图1 各组AdipoR1、AMPK、p38MAPK蛋白表达比较

表5 各组大鼠AdipoR1、AMPK、p38MAPK蛋白比较

2.5 各组大鼠AdipoR1、AMPK、p38MAPK mRNA比较 见表6。与健康组比较,模型组大鼠AdipoR1、AMPK、p38MAPK mRNA均降低(P<0.05);与模型组比较,低剂量组AdipoR1、AMPK、p38MAPK mRNA均升高(P<0.05);与低剂量组比较,中剂量组AdipoR1、AMPK、p38MAPK mRNA均升高(P<0.05);与中剂量组比较,高剂量组AdipoR1、AMPK、p38MAPK mRNA均升高(P<0.05)。

表6 各组大鼠AdipoR1、AMPK、p38MAPK mRNA比较

3 讨 论

临床对于T2DM的治疗常使用胰岛素、双胍类及磺脲类药物等进行干预,尽管有一定疗效,但也在一定程度上引发低血糖及肠道功能紊乱[13-14]。因此,现阶段通过充分发挥中医治疗优势进而寻找有效干预T2DM的方法至关重要。中药黄芪是糖尿病及相关并发症的常用治疗药物,对于多种疾病的治疗均有明显的功效。

T2DM在中医学属于“消渴”范畴,其病机主要是阴虚津亏与盛炙燥热相互作用的结果,中医病理将其总结为“湿炙不济、肾虚津竭、脾损气滞”[13-15]。而血脂代谢紊乱不仅是糖尿病产生的关键病因,也是诱发相关心血管病变的重要危险因素[16]。在T2DM中持续高血脂所产生的脂毒性不仅可对胰岛β细胞产生不良作用,还对增加胰岛素抵抗和破坏糖代谢功能具有重要影响[17-18]。文中结果显示,T2DM大鼠HDL-C偏低,LDL-C、TC、TG偏高,给药后,各剂量组HDL-C均有所升高,LDL-C、TC、TG也有所降低,其中以高剂量组脂代谢水平改善最为显著,提示高剂量芪地糖肾颗粒对调节T2DM时期的脂质代谢水平疗效确切。芪地糖肾颗粒中的生黄芪成分可以增加胰岛素敏感性,通过改善脂肪细胞因子代谢抑制血清游离脂肪酸过度生成,进而改善T2DM时期的脂质代谢异常并调节免疫机制。且有学者在动物研究中发现,芪地糖肾颗粒在改善T2DM大鼠的足细胞损伤方面疗效良好,并可通过调节相关信号功能发挥治疗效用[19]。

胰岛素抵抗是T2DM的病理基础,可由多种途径影响其作用环节并参与T2DM进程[20]。文中研究显示,T2DM大鼠的ISI指数较低而FBC、FINS及HOMA-IR指数均较高,经不同剂量的芪地糖肾颗粒干预后各组大鼠的ISI指数有所升高,FBC、FINS及HOMA-IR指数也有所降低,其中以高剂量组表现最为显著,提示高剂量芪地糖肾颗粒对改善T2DM大鼠的胰岛素水平具有一定积极效用。胰岛素抵抗是引起糖尿病及相关并发症的“动力”根源,常表现为葡萄糖供应障碍,外周及骨骼肌组织的胰岛素敏感性大幅度降低等[21]。现代医学研究表明,肾的病理学机制与胰岛素生物学效应相吻合,而肾虚也是胰岛素抵抗的众多因素之一。中药芪地糖肾颗粒以养精温补为主要治疗原则,方中大黄可通经活络,黄芪、熟地行气温精之效,山萸肉可止遗滋补,芡实固表养内,水蛭养肾通经,白花蛇舌草则有改善下焦浊湿和利于代谢效用。诸药联合应用可在补养调和、标本兼治的同时调节机体血糖代谢[22]。有学者在对早期糖尿病肾病的研究中发现,黄芪可参与糖尿病的胰岛素抵抗调节过程[23]。由此推测,芪地糖肾颗粒改善T2DM的机制可能与多药材共同作用相关,使药物在发挥抑制机体脂肪酸生物合成及提高葡萄糖摄取的同时加快脂肪酸氧化,最终达到降低胰岛素抵抗及胰岛素敏感性的效用。

骨骼肌是机体重要的能量储存中心,并在葡萄糖、脂质代谢等方面具有重要干预作用[24]。本文研究表明,T2DM大鼠骨骼肌中的AdipoR1、AMPK、p38MAPK蛋白均较低,而药物干预后各组大鼠的AdipoR1、AMPK、p38MAPK蛋白均有不同程度的升高,其中以高剂量组升高最为显著。脂联素作为关键脂肪因子可在调节代谢功能的同时促进葡萄糖吸收,并对稳定机体能量平衡有着重要作用。脂联素与AdipoR1相互作用可使AMPK产生磷酸化反应,进而参与调节外周组织对葡萄糖吸收及糖代谢时期靶分子葡萄糖的跨膜转运过程,而AMPK能够通过磷酸化下游靶分子激活p38MAPK进而参与调节脂肪代谢。有学者在研究中发现,黄芪可通过调节糖尿病中AdipoR1、AMPK、p38MAPK相关通路水平改善糖尿病大鼠脂质代谢及反应机制[25]。由此分析,高剂量的芪地糖肾颗粒配伍可能通过发挥中药降糖及调节脂质代谢等机制,使部分信号发挥调节代谢功能及改善紊乱引发的胰岛素敏感性降低现象。

综上所述,芪地糖肾颗粒可对改善T2DM胰岛素抵抗、脂代谢及AdipoR1、AMPK及p38MAPK等蛋白产生有一定调节作用,为临床该药治疗T2DM提供科学依据。由于中药成分复杂且在改善疾病中是多途径的,本次研究对于药物的具体调节路径仍未完全阐明,有待进一步深入研究。