和血柔肝方通过PI3K/Akt/NF-κB信号通路调控自噬相关蛋白改善大鼠肝纤维化机制研究

牛丽娜,窦 婧,马 燕,张 冰,王 尹,王晓忠

(1.新疆医科大学第四临床医学院,新疆 乌鲁木齐 830054;2.新疆维吾尔自治区中医医院,新疆 乌鲁木齐 830099)

肝纤维化是由多种慢性肝病进展至肝硬化、肝衰竭甚至肝癌的中间过程,其特征为细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的合成和降解失衡,导致肝内弥漫性ECM过度沉积[1]。肝纤维化经过治疗后肝组织病理学可明显改善,而肝硬化预后较差。因此早期诊断、及时治疗是防止肝纤维化进展的重要手段。自噬是一种重要的降解机制,可降解受损的细胞器和蛋白质,是维持体内平衡的重要机制。研究表明,自噬功能障碍可加重肝纤维化[2-5]。因此,调节自噬活性在肝纤维化的发生、发展中至关重要,西医往往针对单个基因/蛋白质进行干预[6-8]。中医药治疗肝纤维化则具有多靶点、多途径等独特优势,在治疗肝纤维化中效果突出,其作用在国内外研究中得到广泛认可。

和血柔肝方是结合全国名中医乐德行及全国名老中医曾斌芳教授临证经验并依据新疆地区气候特点因地制宜所拟,为新疆维吾尔自治区中医医院肝病科的协定处方。该方以“和血柔肝、疏肝健脾”为法则。前期研究表明,和血柔肝方治疗乙肝肝纤维化效果突出,可以提高肝纤维化的逆转率,但具体作用机制尚不明确。本课题组进一步通过和血柔肝方干预肝纤维化大鼠模型,结果表明,和血柔肝方最高剂量组疗效最佳,可明显改善大鼠肝脏炎症及肝纤维化程度[4]。同时,本课题组对肝纤维化大鼠肝组织中lncRNA运用RNA测序发现[5],和血柔肝方可能通过磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/ 蛋白激酶B(Akt)信号通路参与肝纤维化的过程。而NF-κB是PI3K/Akt信号通路的下游分子,其诱导自噬蛋白如Beclin-1和LC3-Ⅱ活化后表达增加导致自噬发生[9-12]。近年来,自噬参与肝纤维化的机制逐渐被认识,然而自噬是否促进肝纤维化,抑制自噬是否缓解肝纤维化仍存在诸多争议。本研究拟通过动物实验,观察和血柔肝方通过调控PI3K/Akt/NF-κB信号通路调节自噬相关蛋白,从而改善大鼠肝纤维化的作用机制,丰富中医药治疗肝纤维化的基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：40只7～8周龄SPF级雄性SD大鼠,体重为(160±10)g,购于湖北省实验动物研究中心[许可证号：SCXK(鄂)2020-0018]。适应性饲养7 d后,随机分为空白对照组、模型组、秋水仙碱组与和血柔肝方最佳剂量组(本课题组前期药效学研究结果表明和血柔肝方最高剂量组疗效最优,故设和血柔肝方最高剂量组为最佳剂量组),每组各10只。

1.1.2 药物与试剂：和血柔肝方颗粒剂由柴胡、香附、当归、白术、丹参、桃仁、党参、白芍、茯苓、鳖甲组成,购于四川国药天江药业有限公司。取约1220 g免煎颗粒,加入329 ml温水,充分溶解。浓度约为3.71 g/ml,即为和血柔肝方最佳剂量组。秋水仙碱片,购于上海麦克林生化科技股份有限公司,货号C815210,0.5 mg/片。取6.58 mg秋水仙碱粉剂,加入329 ml的纯水,充分溶解,浓度为0.02 mg/ml。四氯化碳购于上海麦克林生化科技股份有限公司,货号C805332。苏木素(Sigma,货号H9627);伊红Y(国药集团,货号71014544);RNA提取液(维百奥北京生物科技有限公司,型号15596-026);RT-qPCR试剂,定量聚合酶链式反应(qPCR)试剂盒(南京维诺赞生物科技股份有限公司,货号R223-01,Q111-02);DNA聚合酶(天根生化科技有限公司,货号ET105-02);磷酸酶抑制剂,RIPA裂解液(大连美仑生物技术有限公司,货号MB12707,MA0151);BCA蛋白浓度测定试剂盒(广州捷倍斯生物科技有限公司);兔多抗PI3K(美国affinity公司,货号AF6241);兔多抗Akt(美国affinity公司,货号AF6261);兔多抗P65(美国affinity公司,货号AF5006);兔多抗p-PI3K(美国affinity公司,货号AF3241);兔多抗p-Akt(美国affinity公司,货号AF0016);兔多抗p-P65(美国affinity公司,货号AF2006);兔单抗Beclin-1(美国affinity公司,货号ab210498);小鼠单抗LC3(美国affinity公司,货号83506S)。

1.1.3 实验仪器：台式高速冷冻离心机(湖南可成仪器设备有限公司,型号H1-16KR);全自动生化分析仪(深圳雷杜,型号Rayto);PCR仪(杭州米欧仪器有限公司,型号PR-96);垂直电泳槽(北京六一仪器厂,型号DYCZ-24DN);化学发光成像系统(杭州申花科技有限公司,型号SH-523)。

1.2 实验方法

1.2.1 模型建立：40只SPF级SD雄性大鼠适应性饲养7 d后,随机分为空白对照组、模型组、秋水仙碱组与和血柔肝方最佳剂量组,每组各10只。除空白对照组外,其余各组每周2次腹腔注射60% CCl4溶液(CCl4∶橄榄油=3∶2),注射剂量为1.5 ml/kg,以构建肝纤维化大鼠模型,为期8周。造模结束前1周,每组随机选取1只大鼠处死取肝组织,HE及Masson染色评估大鼠肝组织病理改变。

1.2.2 给药方法：空白对照组与模型组以0.9%氯化钠溶液灌胃,剂量为2 ml/(100 g·d);秋水仙碱组予秋水仙碱药液灌胃,剂量为0.2 mg/(kg·d);和血柔肝方最佳剂量组以和血柔肝方灌胃,剂量为37.08 g/(kg·d),连续灌胃4周。

1.2.3 肝功能指标检测：灌胃结束,麻醉大鼠后腹主动脉采血,使用全自动生化分析仪检测血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平。

1.2.4 肝组织病理学观察：解剖大鼠取肝组织,用福尔马林固定后,进行修剪、组织脱水及透明、浸蜡后包埋、切片脱蜡、染色、封片后采用光学显微镜下观察肝组织病理变化。

1.2.5 RT-qPCR技术检测大鼠肝组织PI3K、Akt、NF-κB、LC3-Ⅱ、Beclin-1基因表达水平：取大鼠肝组织,采用Trizol法提取RNA,后将RT逆转录成cDNA,采用HiScript Ⅱ qRT SuperMix Ⅱ配制逆转录反应体系,反应条件：50 ℃、15 min,85 ℃、5 s,4 ℃、10 min,逆转录后进行PCR测定,2-ΔΔCt法处理结果。引物序列见表1。

1.2.6 Western blot法检测大鼠肝组织PI3K、Akt、NF-κB P65、p-PI3K、p-Akt、p-NF-κB P65、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达水平：取大鼠肝组织,将少量的剪碎的组织块置于2 ml EP管中,加干净的钢珠。加200 μl裂解液提取总蛋白,BCA测定蛋白浓度,与缓冲液混合后放入沸水中变性,将预制胶固定到电泳槽上,储液池中倒入电泳液,至溴酚蓝到凝胶底部进行PVDF转膜。用含5%脱脂奶粉的封闭液浸泡PVDF膜,室温摇床封闭2 h。用封闭液稀释相应的一抗(PI3K 1∶1000、Akt 1∶1000、NF-κB P65 1∶1000、p-PI3K 1∶1000、p-Akt 1∶1000、p-NF-κB P65 1∶1000、LC3-Ⅱ 1∶1000、Beclin-1 1∶1000)4 ℃孵育过夜,TBST充分洗涤PVDF膜5次,加入二抗。将ECL试剂中增强液与稳定的过氧化物酶溶液混匀充分反应开始曝光,进行显影、定影。用IPP分析胶片灰度值。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清ALT、AST水平比较 见表2。与模型组比较,和血柔肝方最佳剂量组、秋水仙碱组大鼠血清ALT与AST水平均明显降低(P<0.05);与秋水仙碱组比较,和血柔肝方最佳剂量组大鼠血清的ALT和AST水平稍有升高(P<0.05)。

表2 各组大鼠血清ALT、AST水平比较(U/L)

2.2 各组大鼠肝组织病理学表现 HE染色结果表明,与空白对照组比较,模型组大鼠肝细胞出现广泛的病变,肝血窦毛细血管化,汇管区纤维组织增生,可见大量炎性细胞浸润,产生假小叶;与模型组比较,和血柔肝方最佳剂量组及秋水仙碱组大鼠肝细胞受损可见明显缓解,肝脏结构好转,炎性细胞浸润及纤维增生显著改善(图1)。

A：空白对照组;B：模型组;C：秋水仙碱组;D：和血柔肝方最佳剂量组

Masson染色结果表明,模型组大鼠肝组织可见大量宽大的胶原纤维沉积,假小叶形成;和血柔肝方最佳剂量组及秋水仙碱组大鼠肝组织胶原纤维沉积明显减少。结果表明和血柔肝方可改善肝纤维化,效果显著(图2)。

A：空白对照组;B：模型组;C：秋水仙碱组;D：和血柔肝方最佳剂量组

2.3 各组大鼠肝脏PI3K、Akt、NF-κB、LC3-Ⅱ、Beclin-1基因表达水平比较 见表3。与空白对照组比较,模型组大鼠肝组织PI3K、Akt、NF-κB、LC3-Ⅱ、Beclin-1表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,和血柔肝方最佳剂量组大鼠肝组织中PI3K、Akt、NF-κB、LC3-Ⅱ、Beclin-1表达水平显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);秋水仙碱组大鼠肝组织中PI3K、Akt、NF-κB、LC3-Ⅱ、Beclin-1表达水平明显降低,且差异具有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组大鼠肝脏PI3K、Akt、NF-κB、LC3-Ⅱ、Beclin-1基因表达水平比较

2.4 Western blot法检测大鼠肝组织PI3K、NF-κB P65、Akt、p-PI3K、p-NF-κB P65、p-Akt、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达水平 与空白对照组比较,模型组、秋水仙碱组、和血柔肝方最佳剂量组的PI3K、Akt、p-PI3K、NF-κB P65、p-NF-κB P65、p-PI3K、p-Akt、LC3-Ⅱ、Beclin-1均显著升高(P<0.05);与模型组比较,和血柔肝方最佳剂量组、秋水仙碱组的PI3K、Akt、NF-κB P65、LC3-Ⅱ、Beclin-1均明显降低(P<0.05),见表4(图3)。

图3 各组大鼠肝组织PI3K、Akt、NF-κB P65、p-PI3K、p-Akt、p-NF-κB P65、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达电泳图

表4 各组大鼠肝组织PI3K、NF-κB P65、Akt、p-PI3K、p-NF-κB P65、p-Akt、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达水平比较

3 讨 论

肝纤维化是慢性肝损伤发生时的瘢痕修复反应。在炎症的初始阶段,各种驻留的肝细胞、Kupffer细胞、内皮细胞等被激活,增加细胞因子及活化产物的产生,如TNF-α、TGF-β[13-16]。这些因子及活化产物可调节肝星状细胞的活性,其中PI3K/Akt/NF-κB信号通路是最重要的途径之一：肝损伤后,大量的细胞因子可使肝脏中的PI3K活化。PIP3下游的PDK1可使Akt蛋白的Thr308磷酸化,在磷脂酰肌醇依赖蛋白的激发下Akt被转化为p-Akt,进而使Akt活化。随后活化的Akt激活核因子κB等下游相关靶蛋白,NF-κB调控免疫应答、炎症反应具有重要作用。NF-κB不断活化,再一步调控下游的靶基因表达如自噬标记性蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1从而引发自噬诱导脂滴消化,促进肝纤维化。有研究已经证实,抑制HSC中NF-κB途径调节的自噬是减轻肝纤维化的潜在治疗手段[17-20]。同时也有研究证明,槲皮素通过激活PI3K/Akt信号通路来调控细胞自噬,从而减轻CCl4诱导大鼠肝纤维化程度[21-23]。

近年来,自噬参与肝纤维化的机制逐渐被认识[3,24]。自噬是一种细胞自我降解过程,对于在发育的关键时期平衡能量来源和应对营养压力非常重要。自噬在肝纤维化中的作用取决于细胞的类型和疾病的阶段：肝细胞自噬可减少炎症反应发挥抗肝纤维化作用;但HSC自噬通过促进脂滴降解为HSC激活、分化及分泌ECM提供能量被认为是促进肝纤维化的关键事件。自噬是否促进肝纤维化,抑制自噬是否缓解肝纤维化仍存在诸多争议：一方面,自噬通过抑制炎症反应减轻肝纤维化;另一方面自噬可促使HSC活化,从而加速肝纤维化进程。故仍需要更多证据来明确自噬在肝纤维化发生、发展中的作用。

当前,尚缺乏疗效显著的抗肝纤维化药物,临床主要是针对病因来减少炎症与肝损伤。中医尚无“肝纤维化”病名,但依照其症状当归属“积聚”“胁痛”等范畴。“虚损生积”为其基本病机,肝脏功能受损,日久致气血运行迟缓,气滞血瘀最终导致肝纤维化。近年来,经典的中药复方如扶正化瘀胶囊、复方鳖甲软肝片、安络化纤丸等对治疗肝纤维化取得显著效果[13]。中医药在抗肝纤维化的治疗中,效果明确,且不良反应小[25]。和血柔肝方以逍遥散为基础方,加用党参、白术、鳖甲、桃仁。因新疆地区气候干燥,故方中重用滋阴补血药物。方中当归、白芍同为君药,有血和则肝和之意;柴胡为臣药,行气疏肝;白术、茯苓益气健脾,且能预防肝病传脾;桃仁、丹参活血散瘀;鳖甲软坚化瘀,香附疏肝理气解郁。诸药合用共奏抗肝纤维化之功。本课题前期临床研究已证实该方具有良好的抗乙肝相关肝纤维化的作用。

本实验对肝纤维化大鼠进行药物干预后,大鼠肝功能指标ALT、AST水平较模型组有明显的下降趋势,表明和血柔肝方可改善肝脏炎症。HE及Masson染色结果显示,和血柔肝方最佳剂量组较模型组肝组织结构、炎性细胞浸润及纤维增生程度显著改善。进一步检测各组大鼠肝脏PI3K、Akt、NF-κB、LC3-Ⅱ、Beclin-1基因表达的水平显示,与模型组比较,和血柔肝方最佳剂量组大鼠肝组织中PI3K、Akt、NF-κB、LC3-Ⅱ、Beclin-1基因表达水平显著降低。从各组大鼠肝组织中 PI3K、Akt、NF-κB P65、p-PI3K、p-Akt、p-P65、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达水平来看,与模型组比较,和血柔肝方最佳剂量组、秋水仙碱组的PI3K、Akt、NF-κB P65、LC3-Ⅱ、Beclin-1均明显降低。故该实验结果可表明,和血柔肝方可以通过调控PI3K/Akt/NF-κB信号通路来抑制自噬反应,减少肝脏炎症反应,改善肝脏病理损害,起到缓解肝纤维化的作用。此研究为临床应用进一步提供了和血柔肝方抗肝纤维化新的疗效作用机制和实验依据。