槲芪方加减对肝癌化疗栓塞术后大鼠一氧化氮合酶、血管内皮生长因子、乏氧及免疫功能的影响

孔庆旭,陈桂云,陈自力,李 俊

(1.钟祥市中医院,湖北 钟祥 431900;2.安徽医科大学附属医院,安徽 合肥230032)

肝癌在临床上较为常见,主要是由肝细胞等发生癌变引发的恶性肿瘤,其发病率及病死率均较高[1]。在我国肝癌主要由乙型肝炎诱发,早期多以肝移植的方法进行治疗,中晚期多采用肝动脉化疗栓塞术 (Hepatic artery chemoembolization,TACE)治疗[2]。TACE创伤小,但临床发现单纯进行TACE治疗未能完全消灭肿瘤细胞,有近95%的肿瘤胞膜外可见到残存的肿瘤细胞,残留病灶通过得到新的供血、供氧继续生长或转移[3]。有学者认为这一现象与肿瘤乏氧微环境有关[4]。多种因子参与血管新生与乏氧过程,其中一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)、血管内皮生长因子(Vascular epidermal growth factor,VEGF)具有促进肿瘤细胞供氧、供血的作用,加快肿瘤生长[5-6]。另外有研究发现[7]TACE术后还会导致机体免疫功能降低。在肿瘤产生及发展的过程当中,免疫系统通过多种途径发挥着肿瘤细胞杀伤作用,其中T淋巴细胞在免疫系统中发挥重要作用。调节性T细胞是机体内对免疫反应具有调节作用的细胞,维持机体免疫平衡,其一方面帮助机体对抗疾病,另一方面抑制肿瘤细胞生长。在TACE术后免疫功能降低,会使机体对抗疾病的能力降低并增加肿瘤细胞生长。因此,寻找改善局部乏氧状态、免疫功能,抗血管新生以及促进细胞凋亡的药物对于TACE术后治疗至关重要。中医认为肝癌属于“肝积”“臌胀”范畴,以本虚标实为病机,因虚致病,因邪致实,具体表现为肝郁脾肾气血虚、痰湿疫毒残未尽[8]。槲芪方是由钱英教授总结出的治疗肝癌的中药方,具有滋补肝肾、和血调肝、益气健脾、祛风利湿和解毒通络的作用,与上述肝癌病机相契合。目前已有研究证实槲芪方对于治疗肝癌动脉化疗栓塞术后患者效果显著,但具体作用机制尚未完全掌握,基于此,本实验研究槲芪方加减对肝癌化疗栓塞术后大鼠iNOS、VEGF、乏氧及免疫功能的影响,为相关研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞：肝癌细胞株HepG2购自上海研生实业有限公司。SPF级SD雄性大鼠,购自苏州市顾秀实验动物设备公司,许可证号SCXK(苏)-2021-0203,本次实验已通过我院动物伦理委员会批准,批号20210204。

1.1.2 药物：槲芪方由槲寄生、黄芪、白花蛇舌草各30 g,丹参20 g,莪术6 g等药物组成。槲芪方药材均购自亳州市六顺堂药业有限公司,由我院中医室煎制。

1.1.3 试剂与仪器：全自动生化分析仪(深圳瑞沃德生命科技有限公司,型号Pinnacle),流式细胞仪(贝克曼库尔特商贸有限公司,型号CytoFLEX ),苏木素-伊红染色液(上海古朵生物科技有限公司,货号GD-K4042),TUNEL试剂盒、HIF-1α、VEGF(北京百奥莱博科技有限公司,货号GS0248、YT788-TUV、YT848-SNU),iNOS一抗(上海冠导生物工程有限公司,货号GD-A079581),辣根过氧化物酶二抗(上海研卉生物科技有限公司,货号127-035-099)。

1.2 实验方法

1.2.1 模型建立、分组及干预：于50只大鼠中随机抽取12只作为健康组进行对照,37只大鼠建立肝癌模型。取1只小鼠,将瘤株注入小鼠腹部,7～10 d腹水形成后,传代备用。取1只大鼠,麻醉后将0.5 ml(约5×106个肿瘤细胞)的传代腹水注入大鼠体内,10 d后长出1.5 cm的肿瘤结节,后麻醉大鼠去除结节,剪成约1 mm3的小块备用。将需建模的大鼠备皮,于腹部正中切开,暴露肝左叶,切开部分肝组织等并扩张肝内切口,止血后将一小块肿瘤结节置入,止血后将肝脏送回原位并关腹,缝合。术后,将大鼠安置于安静、舒适的饲养笼里。建模过程中意外死亡1只大鼠,剩余36只大鼠建模成功,随机分为模型组、肝动脉化疗栓塞术组以及联合组,每组12只。肝动脉化疗栓塞术组大鼠给予肝动脉栓塞治疗[9]：将自制的微导管插入肝动脉内,注入5-Fu 20 mg/kg,加超液态碘油0.5 ml/kg,术后拔管,缝合,消毒,分笼饲养。联合组：根据人与动物用药量换算公式,在肝动脉化疗栓塞术组基础上给予模型大鼠27 ml/kg槲芪方灌胃,2次/d,共24周[10]。健康组与模型组大鼠给予同体积 0.9%氯化钠溶液灌胃。

1.2.2 全自动生化分析仪检测各组大鼠肝功能指标水平：末次治疗后,取各组大鼠颈动脉血5 ml,3000 r/min(半径10 cm)离心15 min,取上清。全自动生化分析仪检测血清丙氨酸转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸转氨酶 (Aspartate transaminase,AST)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)水平。

1.2.3 流式细胞仪检测各组大鼠免疫功能指标水平：干预结束后取各组大鼠颈动脉血5 ml,提200 μl外周血单核细胞置于RPMI 1640培养基中培养,加入刺激剂佛波醇乙酯、离子霉素、莫能霉素等工作液混匀,常规培养6 h,PBS清洗,离心5 min,800 r/min,离心半径10 cm,收集细胞,加入5 μl异硫氰酸荧光素标记CD3+、CD4+、CD8+并检测其水平,具体步骤按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 HE染色观察各组大鼠肝组织病理变化：取各组大鼠肝组织,甲醛固定,脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、常规切片,苏木素伊红(HE)染色,进行常规组织学检查。

1.2.5 原位末端标记法(TUNEL)检测各组大鼠肝癌细胞凋亡：取各组大鼠肝组织石蜡切片脱蜡,加入蛋白酶工作液,常温孵育15 min,磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤后加入TUNEL液,常温无光孵育1 h,PBS清洗,加50 μl convertr-POD,无光孵育0.5 h。PBS清洗,3,3-二氨基苯联胺液显色,PBS冲洗,苏木素复染,脱水透明,封片。荧光显微镜下观察并计数发荧光的阳性细胞。凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.2.6 免疫印迹检测各组大鼠VEGF、iNOS、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)蛋白表达：肝组织采用0.125%胰蛋白裂解液,匀浆,4000 r/min离心后,进行电泳,转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,PBS冲洗,5 min/次,加入VEGF、iNOS、HIF-1α(1∶500)一抗及 GAPDH抗体(1∶1000 )、过氧化物酶标记二抗(1∶2000),杂交处理4 h后,冲洗,将膜浸入电化学发光(ECL)工作液,检测获取图像。

2 结 果

2.1 各组大鼠肝功能水平比较 见表1。与健康组比较,模型组、肝动脉化疗栓塞术组与联合组ALT、AST、ALP水平均升高(P<0.05),与模型组比较,肝动脉化疗栓塞术组与联合组ALT、AST、ALP水平均降低(P<0.05),肝动脉化疗栓塞术组ALT、AST、ALP水平均高于联合组(P<0.05)。

表1 各组大鼠肝功能水平比较(U/L)

2.2 各组大鼠免疫功能水平比较 见表2。与健康组比较,模型组、肝动脉化疗栓塞术组与联合组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均降低,CD8+升高(P<0.05),模型组与联合组比较差异无统计学意义(P>0.05),与模型组及联合组比较,肝动脉化疗栓塞术组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均降低,CD8+升高(P<0.05)。

表2 各组大鼠免疫功能水平比较

2.3 各组大鼠肝组织病理变化比较 健康组大鼠肝组织结构正常;模型组大鼠肝细胞排列杂乱无章,细胞肿胀,胞质呈空泡状;肝动脉化疗栓塞术组大鼠肝细胞排列不规则,有少量空泡;联合组大鼠肝细胞排列紧密,仅见少量肿胀(图1)。

A：健康组;B：模型组;C：肝动脉化疗栓塞术组;D：联合组

2.4 各组大鼠肝癌细胞凋亡比较 见图2。健康组、模型组、肝动脉化疗栓塞术组与联合组大鼠肝癌细胞凋亡率分别为(1.25±0.14)%、(3.17±0.36)%、(14.35±1.48)%、(19.62±2.05)%。健康组细胞凋亡率低于模型组、肝动脉化疗栓塞术组与联合组(P<0.01),模型组细胞凋亡率低于肝动脉化疗栓塞术组与联合组(P<0.01),肝动脉化疗栓塞术组细胞凋亡率低于联合组(P<0.01)。

A：健康组;B：模型组;C：肝动脉化疗栓塞术组;D：联合组

2.5 各组大鼠VEGF、iNOS、HIF-1α蛋白表达比较 见表3(图3)。与健康组比较,模型组、肝动脉化疗栓塞术组与联合组VEGF、iNOS、HIF-1α表达均升高(P<0.05),与模型组比较,肝动脉化疗栓塞术组VEGF、iNOS、HIF-1α表达均升高(P<0.05),与模型组及肝动脉化疗栓塞术组比较,联合组VEGF、iNOS、HIF-1α表达均降低(P<0.05)。

图3 各组大鼠HIF-1α、iNOS、VEGF蛋白表达电泳图

表3 各组大鼠VEGF、iNOS、HIF-1α蛋白表达比较

3 讨 论

肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一,早期无明显症状但疾病进展较快,术后复发较高,严重威胁患者生命安全[11]。而TACE术是一种常见的肝癌治疗方法,虽然可提高临床疗效,但该治疗方法仍存在局限性,如易导致肝组织损伤、免疫功能下降等。槲芪方作为一种传统中药方剂被广泛应用于肝癌治疗,并取得了一定的疗效。因此,本研究通过对比肝动脉化疗栓塞术组和联合组的指标水平,旨在探究槲芪方加减对肝癌化疗栓塞术后大鼠的影响,为肝癌治疗提供新的思路。

肿瘤缺氧环境中,会使得HIF-1α水平增加,促进iNOS含量增加并产生一定的一氧化氮,增加VEGF表达,促进肿瘤血管生成[12-14]。VEGF是促血管新生的重要因子,与其受体结合后通过磷酸肌醇等途径调控iNOS表达,诱导一氧化氮产生,促进肿瘤细胞增殖,诱导血管新生,形成恶性循环[15]。研究提示[16],TACE术后,肿瘤并未完全坏死,癌中心及癌周仍有大量存活的癌细胞,这些癌细胞存在于不同程度的乏氧环境中。已有研究表明[17],HIF-1α能够诱导VEGF、iNOS促进血管新生,加快肿瘤的增殖及转移。中医认为肝癌的病机为本虚标实,治疗肝癌应重视气血、脏腑间的关系,并主张将“补肝体” 和 “益肝用”运用于肝癌治疗中。槲芪方具有补气养血、温阳健脾、滋补肝肾、祛风通络等功效,符合上述病机。该方中以黄芪、槲寄生、丹参为君药,益气固表、滋补肝肾;白花蛇舌草、莪术为臣药,清热解毒、活血化瘀。研究提示,槲芪方可有效提高肝癌患者临床疗效[18]。本研究与上述结果相似,也证实了槲芪方可改善肝癌大鼠的肝功能,另外TUNEL结果也显示槲芪方加减可促进肿瘤细胞凋亡。此外,现代医学也表明黄芪、莪术[19]、白花蛇舌草[20]均可通过调控HIF-1α、VEGF治疗肿瘤。本研究结果显示术后HIF-1α、VEGF、iNOS水平升高,认为可能是由于TACE刺激,HIF-1α、iNOS被激活,产生肿瘤致癌基因,诱发癌变,使得VEGF增加,加重癌变。槲芪方治疗后HIF-1α、VEGF、iNOS水平降低,提示TACE增加了肿瘤局部微环境的乏氧,而槲芪方则显著降低HIF-1α、iNOS的表达,提示槲芪方对于术后肿瘤乏氧微环境具有改善作用;VEGF水平也显著降低,提示槲芪方通过改善术后乏氧环境,抑制肿瘤血管新生,间接起到抑制侵袭的作用。

TACE的临床应用发现其会导致患者的免疫功能降低并损坏肝脏组织,严重者会促进病情发展。文献报道[21],肝癌术后患者的免疫功能与远期转移风险密切相关。T淋巴细胞在免疫系统中发挥着重要作用。其中CD3+、CD4+、CD8+是T淋巴细胞的重要成员,参与机体的免疫调节。CD4+具有抗肿瘤的作用,CD8+是机体发挥免疫抑制的关键,CD4+/CD8+可反映患者机体免疫抑制程度[22]。行TACE术治疗后机体气血耗损状态进一步加重,槲芪方以滋补肝肾、益气健脾、和血调肝等为主要治疗原则,符合气血耗损的治疗。槲芪是桑寄生科槲寄生属植物,性平味苦,归肝、肾经,功可祛风湿、补肝肾、强筋骨、养血[23]。槲芪方不仅具有辅助抗肿瘤及免疫调节作用,而且还具有直接抗肿瘤和抑制肿瘤转移作用。槲寄生提取物多糖及总碱可抑制肝癌细胞的增殖,促进其凋亡。生黄芪健脾益气,丹参和血养肝,郁金解郁化痰,白花蛇舌草祛疫解毒,莪术化瘀消癥,水红花子化瘀通络,苦参利湿解毒,全方调补肝脾肾气血为主,利湿解毒活血通络消癥为辅。现代研究提示,槲芪方中黄芪、莪术、槲寄生、丹参等中药材均具有提高免疫功能的作用[24-25]。在本实验中经过TACE治疗后免疫功能降低,经过槲芪方治疗后免疫功能显著增加,提示槲芪方具有提高TACE术后患者免疫功能的作用,这与上述研究结果相似。

综上所述,槲芪方加减可提高肝癌TACE术后大鼠的免疫功能,通过抑制肝癌大鼠乏氧微环境中HIF-1α、iNOS及VEGF水平,改善乏氧微环境,促进肿瘤细胞凋亡。