植物乳杆菌发酵对富硒发芽糙小米饮料风味特征的影响

周大宇，门雨薇，金子灿，华正莹，楚彩云，薛井生，卢丙轩，马涛*

（1.渤海大学食品科学与工程学院，辽宁锦州 121013；2.葫芦岛后峪生态农业科技有限公司，辽宁葫芦岛 125001；3.辽宁寨香生态农业股份有限公司，辽宁本溪 117007）

近年来，随着我国经济水平不断提高，食材的精细化加工在具有良好风味口感的同时，造成大量营养素的损失，导致我国高血压、高血糖和高血脂的发病率逐年上升，因此营养全面的全谷物类食品受到消费者的广泛关注。粟米又称糙小米、谷子，属禾本科植物，卵圆形籽实，粒小多为黄色，去壳后俗称小米[1]。与小米相比，糙小米由胚乳、胚芽和皮层组成，含有更丰富的功能性营养元素，但糙小米富含纤维的皮层使籽粒不易炊熟，产品风味口感不佳，因此采用现代集成技术改善糙小米的感官品质具有重要意义。

硒是人体必需的微量营养元素，富硒食品在发挥功能作用的同时，对食品的风味也起到改善作用。Gao等[2]研究发现以富硒大豆为原料酿制酱油，可显著提高酱油的口感和芳香性化合物含量。发芽是提高谷类感官品质的重要手段，谷物发芽过程中，多糖和蛋白质转化为寡糖和氨基酸，并提升谷物的风味与口感[3]。Sun 等[4]研究发现，以发芽糙米为原料制成的馒头，感官品质显著提高，其他醇类香气成分显著增多。仲梦涵等[5]研究发现，烘烤发芽大麦茶产生的挥发性风味物质与未发芽大麦茶相比香气种类更加丰富，风味更好。益生菌被广泛应用于食品中，改善食品风味与营养。植物乳杆菌属于乳酸杆菌科中的乳酸杆菌属，革兰阳性兼性厌氧发酵，被广泛地应用于乳酸菌饮料、酸奶、发酵调味料等食品中，提升产品风味品质；Wang等[6]研究中发现，经过植物乳杆菌发酵的米糠和麦麸异味风味含量减低。基于上述研究，本试验分别以富硒发芽糙小米、富硒糙小米、发芽糙小米以及普通糙小米为原料通过感官评定、气相色谱⁃质谱联用（gas chro⁃matography⁃mass spectrometry，GC⁃MS）和电子舌、电子鼻技术，分析植物乳杆菌发酵对糙小米饮料风味特征的影响，以期为进一步开发高质量富硒发芽糙小米食品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糙小米、富硒糙小米：葫芦岛后峪生态农业科技有限公司；中温α⁃淀粉酶（酶活10 000 U/g）、植物乳杆菌550：四川高福记生物科技有限公司；MRS 肉汤培养基：青岛高科园海博生物技术有限公司；无水氯化钙、磷酸氢二钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；氯化钠（分析纯）：辽宁泉瑞试剂有限公司；环己酮（分析纯）：上海晶纯生化科技股份有限公司

1.2 仪器与设备

PL303 电子天平：梅特勒⁃托利多仪器（上海）有限公司；PEN3 电子鼻、SA402B 电子舌：日本Insent 公司；DF⁃101S 集热式恒温加热磁力搅拌器：郑州长城基金科工贸有限公司；7890A 气相色谱⁃质谱联用仪、HP⁃5MS 弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 µm）：美国安捷伦科技有限公司；50/30µm DVB/CAR/PDMS 萃取头、20 mL 顶空钳口样品瓶、固相微萃取装置：美国Supelco 公司；SPX⁃150B⁃Z 生化培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 发芽糙小米、富硒发芽糙小米的制作

参考华正莹等[7]的方法并稍作改动。将洗净除杂后的糙小米、富硒糙小米在3.5 mmol/L CaCl2溶液、35 ℃条件下恒温浸泡13 h 后，在31 ℃下恒温发芽48 h，得到发芽糙小米和富硒发芽糙小米。

1.3.2 糙小米饮料的制作

参考郭敏等[8]的方法并稍作改动。洗净除杂后的糙小米制粉，过80 目筛，加水[料液比为1∶12（g/mL）]，100 ℃糊化20 min，调pH 值至6.4 后加入中温α⁃淀粉酶，90 ℃酶解50 min，杀菌、冷却后即为糙小米饮料。富硒糙小米、发芽糙小米以及富硒发芽糙小米的饮料制备方式与上述相同。

1.3.3 糙小米发酵饮料的制作

参考侯金丽[9]的方法并稍作改动。菌种活化及母发酵剂的制备：植物乳杆菌菌粉按0.1%的质量比接种于MRS 肉汤培养基中，37 ℃培养12 h，再以3%（体积分数）接种于试管MRS 肉汤培养基中37 ℃培养12 h，两次活化后活菌数达到9×109CFU/mL 以上。将上述母发酵剂按2%接种量加入糙小米饮料，再加入3%蔗糖，37 ℃恒温发酵10 h，即得糙小米发酵饮料。富硒糙小米、发芽糙小米以及富硒发芽糙小米的植物乳杆菌发酵饮料制备方式与上述相同。

1.3.4 感官分析

将样品按照GB/T 29605—2013《感官分析食品感官质量控制导则》[10]中所述的方法设置感官评价的指标，选取10 名评价员，男女比例1∶1。经基本味道识别能力、观察阈、识别阈培训后，对气味、滋味、组织状态3 个方面进行感官品评、打分，采用百分制，感官评价标准见表1。

表1 糙小米饮料感官评价标准Table 1 Sensory evaluation of brown millet beverage

1.3.5 电子鼻分析

电子鼻测定：参考李东红等[11]的方法并稍作修改。取10 mL 样品于样品瓶中，用3 层保鲜膜密封，平衡20 min 后，进行气味测定。电子鼻清洗时间为100 s，样品准备时间为5 s，检测时间为120 s，进行3 次重复试验。电子鼻的传感器是由10 种金属氧化物半导体型化学传感元件组成，不同传感器的性能描述如表2所示。

表2 PEN3 便携式标准传感器阵列及性能Table 2 PEN3 portable standard sensor array and its performance

1.3.6 电子舌分析

用电子舌进行味觉分析，味觉传感器由5 个测试传感器和2 个参考传感器组成，其中重要的5 个测试传感器为CT0、CA0、C00、AAE 和AE1，分别代表咸、酸、苦、鲜和涩味。取60 mL 样品抽滤过膜后置于样品杯中进行测定，每个样品测试4 次，取3 次稳定数据进行分析。为了减小测量误差，其余的样品槽放置正负电极液和基准液。

1.3.7 GC⁃MS 检测

参考宋虹等[12]的方法并稍作修改。

样品处理：取5.0 g 样品放入15 mL 带聚四氟乙烯隔膜的顶空瓶中，加入1.8 g NaCl，再加入10 µg 环己酮，混合均匀。55 ℃恒温水浴平衡10 min，再把固相微萃取手动进样柄的针头插入顶空瓶中。将纤维伸出置于样品上空的气体中萃取45 min，然后缩回纤维将萃取头拔出顶空瓶并立即插入气相色谱⁃质谱进样口。再次伸出纤维在250 ℃条件下进行5 min 解吸。缩回纤维拔出萃取头，开始采集数据进行分析。

色谱条件：分离柱HP⁃5MS 弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 µm）；进样口温度250 ℃；载气He；载气流速0.8 mL/min；不分流进样；升温程序：柱箱初始温度35 ℃保持3 min，以2 ℃/min 升至65 ℃，再以3 ℃/min 升至110 ℃，再以10 ℃/min 升至230 ℃保持7 min。

质谱条件：离子化模式为电子电离（electron ioniza⁃tion，EI）；电子能70 eV；离子源温度200 ℃；发射电流200 µA；传输温度250 ℃；检测气压350 V；数据采集为全扫描。

内标法定量分析：保留匹配度大于800 的物质，根据色谱峰面积计算挥发性化合物的含量，样品中挥发性化合物含量的计算公式如下。

式中：M为挥发性化合物含量，µg/100 g；S1为待测化合物的色谱峰面积；S2为内标物的色谱峰面积；m1为样品质量，g；m2为内标质量，µg。

1.4 数据处理

采用Excel 和SPSS 19 进行数据统计分析，运用方差分析法（analysis of variance ，ANOVA）进行显著性分析；采用Origin 9.0 软件对电子鼻与电子舌响应值做雷达图，并进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 感官评定结果

对糙小米饮料、糙小米发酵饮料、富硒糙小米饮料、富硒糙小米发酵饮料、发芽糙小米饮料、发芽糙小米发酵饮料、富硒发芽糙小米饮料、富硒发芽糙小米发酵饮料8 种糙小米饮料分别按S1～S8 命名。评价员对8 种糙小米饮料样品的组织状态、甜味、酸味、鲜味和米香味的感官评定结果见图1。

图1 糙小米饮料的感官雷达图Fig.1 Sensory radar map of brown millet beverage

由图1 可知，糙小米饮料在不同方式处理下，感官评定有较大差异，S1 糙小米饮料的组织状态、甜味、酸味、鲜味和米香味都是最低；S4 富硒糙小米发酵饮料的组织状态、甜味强度和酸味强度较高；S8 富硒发芽糙小米发酵饮料的组织状态和整体风味较好。

2.2 电子舌分析

电子舌通过模拟人体的舌器官实现对味觉物质快速、准确地检测识别[13]。8 种糙小米饮料特征信号响应值如图2所示。

图2 糙小米饮料电子舌传感器响应雷达图Fig.2 Response radar map of electronic tongue sensor of brownmillet beverage

由图2 可知，糙小米饮料酸味较弱，苦味与苦味的回味明显高于S2～S8。糙小米含有更多的多酚黄酮类物质，可能是糙小米饮料苦涩味更重的原因[14]。富硒对糙小米饮料的影响不明显。发芽会使糙小米饮料鲜味和咸味稍有减弱。经植物乳杆菌发酵后的饮料酸味要高于未发酵饮料，可能是植物乳杆菌可通过进一步生物转化醇、醛、酸等化合物的原因，此外发酵后饮料的苦味、涩味、苦味的回味、涩味的回味降低，丰富度和咸味变化不明显[15]。

2.3 电子鼻分析

电子鼻系统对于样品的挥发性风味物质很灵敏，不同物质轻微的变化即可通过传感器响应值反映。8 种糙小米饮料的电子鼻雷达图如图3所示。

图3 糙小米饮料香气成分响应值电子鼻雷达图Fig.3 Electronic nose radar map of response values of aroma components of brown millet beverage

图3 中每一条直线代表着一个传感器的相对电阻率（G/G0 或G0/G）的变化情况。由图3 可知，不同饮料的风味轮廓之间存在差异，说明8 种饮料的挥发性物质有一定程度的不同。在电子鼻的10 个传感器中，R1、R2、R6、R7、R8、R10 号传感器的响应值变化较为明显，表明传感器对糙小米饮料的芳香化合物、氮氧化物、碳氢化物、硫化氢、醇类、烷烃等挥发性成分较灵敏。通过R1、R2、R6 号传感器的变化规律可以看出，发芽使糙小米饮料芳香化合物、氮氧化物、碳氢化合物升高，而富硒使糙小米饮料芳香化合物、氮氧化物、碳氢化合物降低。

2.4 顶空固相微萃取⁃GC⁃MS 分析

8 种糙小米饮料挥发性组分的分析结果如表3所示，风味物质含量变化如表4所示。

表3 糙小米饮料挥发性组分的分析结果Table 3 Analysis results of volatile components of brown millet beverage

表4 风味物质含量变化Table 4 Change in flavor substance contentµg/100 g

由表3、表4 可知，8 种糙小米饮料在发酵过程中挥发性风味物质种类和含量差异较大，共检测出挥发性物质42 种，主要包括醛类（7 种）、醇类（12 种）、烷类（4 种）、酸类（9 种）、酚类（4 种）、酮类（4 种）、酯类（2 种）。其中醛类物质通常是由酸和酯转化而来，阈值较低，对风味贡献较大[16]。不同处理方式的糙小米在发酵过程中其风味物质的种类和含量有所不同[17]，S1 糙小米饮料共检测出13 种挥发性风味物质，经植物乳杆菌发酵后，S2 糙小米发酵饮料共检测出13 种挥发性风味物质，其中酸类作为发酵的产物，种类增加，含量由0 增长为28.17 µg/100 g，但并未检测出醛类物质。正己醇为豆腥味成分，在S2 糙小米发酵饮料中含量明显降低，饮料风味改善。S3 富硒糙小米饮料风味物质的种类与S1 糙小米饮料明显不同，其醛类、醇类、烷类、酸类等种类较少，但发酵后，风味物质的种类明显增加，同时酸类和酚类含量明显增加，酸类由5.92 µg/100 g 增加至93.71µg/100，酚类由100.69µg/100 g 增加至530.75µg/100 g，对饮料的风味有一定的贡献，如具有香甜和香荚兰豆萃取物的香气的4⁃乙烯基苯酚[18]。S5 发芽糙小米饮料各类化合物含量均减少。但具有特殊挥发性气味且具有较大风味贡献的化合物种类增加，使得发芽后的糙小米饮料味道更加丰富；与S5 发芽糙小米饮料相比，S6 发芽糙小米发酵饮料检测出了奶酪香的壬酸和果香的辛酸。S8 富硒发芽发酵糙小米饮料中检测出23 种挥发性风味物质，与S7 未发酵的富硒发芽糙小米饮料相比，呈香物质2⁃乙基⁃1⁃己醇、壬酸和4⁃乙烯基苯酚等含量明显增加，其中2⁃乙基⁃1⁃己醇赋予样品花香味，对样品风味有较大贡献[19]；壬酸在未发酵的富硒发芽糙小米饮料中未被检出，但赋予富硒发芽糙小米发酵饮料奶酪香气[20]；肖彤等[21]研究中发现，己醛是引起豆腥味的挥发性成分，但在富硒发芽糙小米发酵饮料中并未检出。乙偶姻作为发酵香气的主要成分，存在于发酵过的样品中，其令人愉悦、柔和的奶香确保了发酵饮料的基本风味[22]。

2.5 聚类分析

采用系统聚类分析方法并结合热图进一步探索不同处理的糙小米饮料挥发性风味物质的差异，不同处理的糙小米饮料的挥发性风味物质聚类分析结果如图4所示。

图4 糙小米饮料热图分析Fig.4 Analysis of heat map of brown millet beverage

由图4 可知，热图可直观展示鉴定出的42 种化合物在不同品种中的分布规律，图中颜色由深到浅表示化合物含量由高到低，颜色越深表示化合物含量越高，颜色越浅表示化合物含量越低。聚类分析结果表明：把8 种不同处理的糙小米饮料分为3 类，S1 糙小米饮料为单独一类，醛类物质含量较高，不良风味较多，与其他样品挥发性风味物质差异较大；S2 糙小米发酵饮料、S6 发芽糙小米发酵饮料、S3 富硒糙小米饮料、S7富硒发芽糙小米饮料和S5 发芽糙小米饮料为一类，此类样品中挥发性物质较接近，如产生了壬酸、乙偶姻等风味好的物质，但仍能检测出具有豆腥味的正己醇，这与前面结果相一致；S4 和S8 为一类，证明S4 和S8 中挥发性物质较接近，如壬酸、乙偶姻等含量较高，但在S8 中并未检测出豆腥味的正己醇，证明发芽后饮料风味要优于未发芽饮料，这与陆晨浩等[23]研究结果一致。

3 结论

采用感官评定以及电子鼻、电子舌和GC⁃MS 技术，对不同处理的糙小米饮料进行分析。感官评定结果表明，不同处理的糙小米饮料感官评价差异明显。电子舌和电子鼻测定结果表明，经发酵后的饮料苦味、涩味、苦味的回味、涩味的回味要低于未发酵饮料，从试验结果可以看出，发酵在改良富硒发芽糙小米饮料滋味上具有可行性。应用GC⁃MS 技术结合聚类分析，结果表明，发芽使饮料风味丰富而减少糙小米的不良气味，从而改善样品气味，富硒使挥发性物质含量均有所增加，但检测出的化合物种类减少；饮料发酵过程中产生了新的芳香性物质如1⁃辛烯⁃3⁃醇、乙偶姻、壬酸等，赋予糙小米饮料蘑菇香、奶香，是富硒发芽糙小米发酵饮料的主要风味物质。相比之下，富硒发芽糙小米发酵饮料的风味与口感都更有优势，营养更加丰富，因此具有较大的发展前景。本研究解决糙小米口感差的问题，有助于开发更多营养丰富、口感好的全谷物产品。