益生菌对虾、贝免疫功能调节作用的研究进展

王筱 吴恒梅 冼健安 鲁耀鹏

摘 要：综述了益生菌对虾贝抗氧化能力、免疫功能和肠道屏障的调节作用，介绍了常见益生菌对虾贝生物功能调节的机制，展望了益生菌的研究发展方向。

关键词：益生菌；免疫；虾；贝；机制

近年来，水产养殖业高速发展，高密度、集约化养殖成为常态，水产养殖病害频发，严重制约了水产养殖业的發展。养殖户使用抗生素和化学药物来解决这一问题。由于其对人类的不良影响，抗生素耐药菌株的发展，反复使用导致抗生素功效降低以及环境污染，许多国家已禁止在鱼类和虾等用作人类食品的水生生物中使用抗生素[1-2]。寻找绿色无污染、无毒副作用的抗生素代替品成为养殖行业的当务之急。益生菌具有无毒副作用、无耐药性、作用稳定等优点，作为抗生素代替品有广阔的应用前景。已有大量的研究证明了益生菌对水生动物的生长、消化、免疫以及抗病力有着积极作用[3-6]，但益生菌对虾类和贝类免疫功能的影响及作用机制的相关报道较少。因此本文旨在综述益生菌对虾、贝的免疫功能调节作用及具体机制，以期为益生菌在虾、贝养殖业中的应用提供理论参考。

1 益生菌的主要功能

益生菌是一种可定植于水产动物肠道或改善养殖水质的有益微生物。活菌的应用已有上百年的历史。1908年，俄国生物学家首次提出将活菌应用于疾病治疗[7]。20世纪80年代益生菌在日本投入使用，最初使用的益生菌是双歧杆菌活菌，其在治疗腹泻、抗衰老、抗肿瘤等方面有着不错的功效[8]。目前，益生菌的制备技术已逐渐成熟，可利用分子生物学和基因工程等技术改造菌种基因，获得更加优良的菌种。益生菌因其提高动物生长性能、改善肠道健康、提高动物免疫力等作用在虾、贝养殖业得到了广泛应用。芽孢杆菌Bacillus aquimaris SH6对凡纳滨对虾的生长、免疫以及体内虾青素的积累均有着积极作用[9]。此外，芽孢杆菌Bacillus aquimaris SH6的孢子在对虾肠道定植后，改善了虾肠道微生物多样性，增强了虾的免疫力[10]。盐红菌Halorubrum提高了凡纳滨对虾对盐度的耐受性和对氨氮的耐受性[11]。饲喂乳酸菌改善了凡纳滨对虾肠道菌群，抑制虾消化道弧菌数量[12]，提高虾的生长性能和抗逆性[13]。乳酸菌能够显著抑制牡蛎体内的副溶血弧菌[14-15]。枯草芽孢杆菌E20提高了凡纳滨对虾在弧菌胁迫下的存活率，显著提高了虾体的抵抗力[16]。益生菌对虾、贝类的正向调节作用是其广泛应用于水产养殖调控疾病和提高抵抗力的基础。

2 益生菌对虾、贝抗氧化能力的调节作用及机制

2.1 益生菌对虾、贝抗氧化能力的调节作用

超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶在虾、贝体内发挥着不可或缺的作用，是反应机体抗氧化能力的重要指标。益生菌被虾、贝摄入后，对于其抗氧化能力有一定的调节作用，能够提高抗氧化酶活力。樊英等[17]在凡纳滨对虾饲料中分别添加活菌数量为108 CFU/g的地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌，试验周期为28 d，在第7、14、21、28天分别取样测定对虾CAT、GSH-Px、SOD、一氧化氮合酶（NOS）活性和总抗氧化能力（T-AOC）的活性，试验结果表明，凝结芽孢杆菌组T-AOC活性在试验第7天最高，地衣芽孢杆菌组在第14天最高；2个试验组CAT活性在第21天达到最高值，SOD活性在第7天最高，而2个试验组之间无显著差异；凝结芽孢杆菌组GSH-Px活性在第28天最高，地衣芽孢杆菌组在第21天最高；凝结芽孢杆菌组NOS活性和NO含量均在第14天最高；地衣芽孢杆菌组NO含量在第28天最高，且试验组抗氧化酶活性均显著高于对照组。

2.2 调节机制

在机体代谢过程中会产生活性氧（ROS）物质，如超氧阴离子（O-2）、过氧化氢（H2O2）、氢氧离子（OH-）、单线态氧（O2）和活性氧中间体（ROI）等，ROS会使微生物产生损伤，需要在抗氧化酶的作用下被清除[18]，因此抗氧化酶能够抑制机体的免疫应激反应。益生菌细胞内含有氧化还原系统，氧化还原系统主要由GSH系统、硫氧还蛋白系统和“NADH氧化酶/NADH过氧化酶”系统构成，能通过氧化还原作用产生谷胱甘肽，为动物体吸收后有效提高机体的抗氧化能力[19]。益生菌细胞膜对电荷有吸附作用，能够消除阳离子电荷，从而达到清除生物体内活性氧和自由基的目的，保护机体免受伤害[20]。

2.2 益生菌对虾、贝免疫功能的调节作用

2.2.1 免疫酶活力 在虾、贝类免疫系统中碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、溶菌酶（LZM）、酚氧化酶（PO）等免疫酶发挥了重要的防御作用。米锐等[21]配置四种饲料：基础饲料、桑叶提取物饲料、地衣芽孢杆菌饲料、地衣芽孢杆菌桑叶提取物复合饲料，进行为期30 d的虾夷扇贝养殖实验，分别于第0、10、20、30天取样测定虾夷扇贝的免疫酶活性，实验结果表明，随着时间的增加，各组AKP、ACP活性呈逐渐升高趋势，实验组AKP、ACP活性显著高于对照组，其中复合组和地衣芽孢杆菌组效果最佳；溶菌酶活性呈上升趋势，实验组活性均高于对照组，复合组活性显著高于其他组。王振刚[22]在凡纳滨对虾饲料中添加枯草芽孢杆菌、海洋红酵母及枯草芽孢杆菌和海洋红酵母混合菌，饲养56 d后检测相关免疫酶活力，实验结果显示，添加益生菌的实验组与对照组相比ACP活性有所提高，其中混合菌组和海洋红酵母组显著高于对照组和枯草芽孢杆菌组，枯草芽孢杆菌组较对照组ACP活性有所提高但不显著；与对照组相比，各实验组AKP活性均显著提高。

2.2.2 免疫基因表达 过度开发、高密度养殖及其他人为因素引起了养殖动物化学或生物应激反应，导致某些细胞基因上调[23]。在可持续水产养殖中，确定免疫基因表达等其他参数能够在一定程度上反应某种化学因素或其他因素对生物体的影响。最常测定的虾、贝免疫基因有热休克蛋白、酚氧化酶原、血蓝蛋白。热休克蛋白（HSPs）是生物体中广泛存在的一种应激蛋白质。当机体受到如高温、酸、氧化剂或者机械损伤等外部刺激时，能够激活热休克蛋白基因的表达，来保护机体。HSPs对于动物体至关重要，能够提高机体细胞的热耐受能力，参与一些蛋白分子的合成与分解。酚氧化酶（PO）在虾、贝非特异性免疫中尤为重要，机体损伤时，PO与黑色素一起抵御和杀灭外来病原菌，促进伤口愈合[24-25]。PO一般以无活性的酚氧化酶原（proPO）的形式存在，proPO主要存在于成熟的血细胞中，特异性受体识别到微生物后会被激活，水解为PO[26]。血蓝蛋白是一种含铜呼吸蛋白，存在于某些软体动物和节肢动物的血淋巴中。氧气与血蓝蛋白的铜离子结合后呈蓝色，被运输到机体各处。此外，血蓝蛋白还是虾、贝重要的免疫物质。许多研究表明，血蓝蛋白具有抗病毒、抑菌作用[27]。Zhang等[28]证明了凡纳滨对虾中的血蓝蛋白对白斑杆状病毒（WSSV）和石斑鱼虹彩病毒（SGIV）有抑制作用。Nesterova等[29]研究了脉红螺血蓝蛋白对疱疹病毒（EBV）的免疫活性。Tadese等[30]配制3种大黄素水平（0、25和50 mg/kg）和3种丁酸梭菌水平（0、250和500 mg/kg，2×107 CFU/g）的实验饲料，在氨氮水平0.2 mg/L下饲喂罗氏沼虾56 d，单用大黄素与丁酸梭菌互作对HSP70表达均有显著影响，单用丁酸梭菌对应激前HSP70表达影响不显著。氨刺激后，HSP70的表达被大黄素和丁酸梭菌的单独和协同作用下调。Casillas-Hernndez等[31]研究表明饲料添加解淀粉芽孢杆菌可诱导凡纳滨对虾血蓝蛋白、多酚氧化酶、HSP60基因显著上调。益生菌诱导宿主的免疫基因上调，提高宿主的抵抗力，不仅可以减少疾病的发生，还可增加养殖品种的产量。

2.3 益生菌对虾、贝肠道屏障的调节作用

2.3.1 肠道结构 肠的形态状态，如绒毛长度、肌层厚度和杯状细胞数量，对营养物质的消化和吸收起着重要作用。虾、贝的肠道不仅是消化和吸收的场所，还是重要的免疫器官。肠道以其特殊的结构特征在阻止异物入侵中發挥着重要作用。肠道上皮细胞及其连接物维持着肠道的选择透过性，能够有效阻止病原菌、毒素进入肠道。肠道黏膜往往由胃液、胆汁、黏蛋白、黏多糖及消化酶组成，肠道黏膜具有抑制有害菌、病毒定植，保护肠组织免受损伤的作用[32]。Hamidoghli等[33]在凡纳滨对虾饲料中添加不同含量的酵母水解物（0.5%、1%、2%、4%），饲喂8周，取1 cm虾肠，观察其形态发现，4%组的虾肠道绒毛排列更整洁有序，绒毛长度和肌层厚度显著高于其他组。Duan等[34]将浓度为1×109 CFU/g丁酸梭菌以不同添加量加入到日本囊对虾饲料中（0、100、200 mg/g），养殖56 d后取样，使用HE染色，将虾肠制成切片，置于显微镜下观察发现，丁酸梭菌添加组上皮细胞紧密相连，肠道绒毛排列整齐致密，肌层厚度增加。

2.3.2 肠道微生物 据研究表明，动物肠道中的微生物数量达到了1012[35]，其中大多数细菌属于厚壁菌门和拟杆菌门[36]。这两种菌门含有大量益生菌，如芽孢杆菌、乳杆菌等。肠道菌群对机体的健康和新陈代谢至关重要。肠道微生物参与机体的消化、能量产生、营养物的吸收、代谢及免疫。肠道微生物受到环境变化或病菌感染时，肠道菌群平衡受到破坏，益生菌生长繁殖被抑制，病原菌在机体内迅速定植。益生菌依靠其黏附作用在肠道内定植，形成种群优势，与病原菌形成竞争关系，维持肠道屏障。益生菌产生抗菌肽抑制病原菌的生长繁殖，抗菌肽是机体重要的免疫蛋白，抗菌肽通过与病原菌竞争占位来抑制其定植，还可作为信号蛋白为益生菌和免疫系统传递信号[37]。茹媛媛[38]在红螯螯虾饲料中添加不同浓度的乳酸乳球菌（1.5×106、1.5×107、1.5×108 CFU/g），饲喂60 d，经肠道微生物高通测序发现，各试验组螯虾的肠道菌群结构与对照组相比均发生了显著变化，以添加量为 1.5×107 CFU/g组变化最大，其中变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、γ-变形杆菌纲（Gammaproteobacteria）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）是肠道优势菌群，Alpha多样性分析、物种组成分析和功能预测结果表明，添加量为 1.5×107 CFU/g组有较好的肠道微生态环境，微生物菌群最丰富，有益菌数量和种类均最多。Fan等[39]使用地衣芽孢杆菌1×108CFU/g的饲料，饲喂凡纳滨对虾35 d，试验结束时，与对照组相比试验组虾肠道中乙酸、丁酸含量显著提高，16s RNA测序结果显示，地衣芽胞杆菌增加了部分细菌的多样性和丰度，变形菌门和类浮霉状菌属的丰度下降，厚壁菌门和拟杆菌门的丰度增加，因此，地衣芽孢杆菌调节了虾肠道菌群组成。Azad等[40]研究了芽孢杆菌、丁酸梭菌、粪肠球菌组成的混合益生菌（1.10 ×106 CFU/g）对罗氏沼虾免疫的影响，此实验分为三个对照组和三个实验组，三个对照组分别为一个阴性对照（Cn）即不施用益生菌及病原菌和两个阳性对照，两个阳性对照分别记为Cv和Ca组，Cv组只施用弧菌，Ca组只施用水气单胞菌。三个处理组分为T1、T2、T3，T1组使用益生菌处理虾，但不接种病原菌；T2益生菌喂养罗氏沼虾，使用弧菌攻毒罗氏沼虾；T3饲喂益生菌，进行水气单胞菌攻毒，该实验共进行60 d。实验结果表明，各处理组虾肠道内容物细菌总密度均有升高趋势，攻毒试验结束时，益生菌添加组的罗氏沼虾成活率显著高于对照组。

3 展望

随着益生菌在水产养殖中的研究取得显著进展，益生菌现已被农业部批准作为饲料添加剂用于水产养殖。关于未来益生菌在水产养殖中的应用研究，可重点关注益生菌的选择和作用机理。今后，可从以下几个方面进行研究：一是益生菌对水生病原体的拮抗作用机制尚不清晰，益生菌的长期使用对病原菌的作用效果也不确定，因此应深入探讨益生菌的作用机理。二是益生菌具有向病原菌转移耐药基因的风险，应仔细评估益生菌作用与水生动物的潜在危险。三是当前对于益生菌的有益效用机制的研究较少，其作用机理尚不明确。因此，需要通过转录组、代谢组、蛋白组等手段研究益生菌细胞的结构成分、代谢产物、酶和功能蛋白等，为益生菌的作用机理提供依据。

参考文献：

[1]LIMBU S M，ZHOU L，SUN S X，et al.Chronic exposure to low environmental concentrations and legal aquaculture doses of antibiotics cause systemic adverse effects in Nile tilapia and provoke differential human health risk[J].Environment International，2018，115：205-219.

[2] 廖乙露，刘翰吉，李明帅，等.微生态制剂在水产养殖中研究现状[J].饲料工业，2021，42（2）：48-54.

[3] CAO K，ZHI R，ZHANG G.Photosynthetic bacteria wastewater treatment with the production of value-added products： a review[J].Bioresource technology，2020，299：122648.

[4] LEE S，KATYA K，HAMIDOGHLI A，et al.Synergistic effects of dietary supplementation of Bacillus subtilis WB60 and mannanoligosaccharide （MOS） on growth performance， immunity and disease resistance in Japanese eel， Anguilla japonica[J].Fish & shellfish immunology，2018，83：283-291.

[5] ELSABAGH M，MOHAMED R，MOUSTAFA E M，et al.Assessing the impact of Bacillus strains mixture probiotic on water quality， growth performance， blood profile and intestinal morphology of Nile tilapia， Oreochromis niloticus[J].Aquaculture nutrition，2018，24（6）： 1613-1622.

[6] XU W，MAWOLO P Y，GAO J，et al.Effects of supplemental effective microorganisms in feed on the growth， immunity， and appetite regulation in juvenile GIFT tilapia[J].Aquaculture Reports，2021，19：100577.

[7] 鄔立刚.饲用微生态制剂研究进展[J].饲料与畜牧，2013（7）：48-50.

[8] 谢海伟，文冰，李晓燕，等.微生态制剂的应用研究[J].广东化工，2021，48（24）：17-19.

[9] NGO H，NGUYEN T，NGUYEN Q，et al.Screening of pigmented Bacillus aquimaris SH6 from the intestinal tracts of shrimp to develop a novel feed supplement for shrimp[J].Journal of applied microbiology，2016，121（5）：1357-1372.

[10] NGUYEN H T，NGUYEN T T，PHAM H T T，et al.Fate of carotenoid-producing Bacillus aquimaris SH6 colour spores in shrimp gut and their dose-dependent probiotic activities[J].Plos one，2018，13（12）：e0209341.

[11] XIE W，MA Y，REN B，et al.Artemia nauplii enriched with archaea Halorubrum increased survival and challenge tolerance of Litopenaeus vannamei postlarvae[J].Aquaculture，2020，533： 736087.

[12] 姜松，蒋华杰，周发林，等.2种微生态制剂对南美白对虾育苗的影响[J].河南农业科学， 2018，47（4）：130-134.

[13] 柯杨勇，赖秋明，苏树叶，等.1株乳酸菌在凡纳滨对虾养殖中的应用效果[J].热带生物学报， 2015，6（1）：18-24.

[14] SOREE M，KOLYPCZUK L，HADJIEV E，et al.Screening of marine lactic acid bacteria for Vibrio parahaemolyticus inhibition and application to depuration in Pacific oysters （Crassostrea gigas）[J].Journal of applied microbiology，2022，134（2）：lxac081.

[15] KHOUADJA S，HADDAJI N，HANCHI M，et al.Selection of lactic acid bacteria as candidate probiotics for Vibrio parahaemolyticus depuration in pacific oysters （Crassostrea gigas）[J]. Aquaculture Research，2017，48（4）：1885-1894.

[16] ADILAH R N，CHIU S T，HU S Y，et al.Improvement in the probiotic efficacy of Bacillus subtilis E20-stimulates growth and health status of white shrimp， Litopenaeus vannamei via encapsulation in alginate and coated with chitosan[J].Fish & Shellfish Immunology，2022，125：74-83.

[17] 樊英，王晓璐，刘洪军，等.益生菌制剂对凡纳滨对虾生长、营养代谢及抗氧化能力的影响[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2020，48（8）：1-9.

[18] PANIGRAHI A，SUNDARAM M，SARANYA C，et al.Carbohydrate sources deferentially influence growth performances， microbial dynamics and immunomodulation in Pacific white shrimp （Litopenaeus vannamei） under biofloc system[J].Fish & Shellfish Immunology，2019，86：1207-1216.

[19] DI CAGNO R，SURICO R F，PARADISO A，et al.Effect of autochthonous lactic acid bacteria starters on health-promoting and sensory properties of tomato juices[J].International Journal of Food Microbiology，2008，123（3）：473-483.

[20] KANNO T，KUDA T，AN C，et al.Radical scavenging capacities of saba-narezushi， Japanese fermented chub mackerel， and its lactic acid bacteria[J].LWT-Food Science and Technology，2012，47（1）：25-30.

[21] 米锐，关晓燕，王庆志，等.地衣芽孢杆菌复合桑叶提取物对虾夷扇贝的益生作用[J].水产科学，2023，42（5）：8131-820.

[22] 王振刚.益生菌对凡纳滨对虾生长、免疫、肠道菌群、差异基因表达的影响[D].大连：大连海洋大学，2022.

[23] DAWOOD M A O，KOSHIO S，ABDEL-DAIM M M，et al.Probiotic application for sustainable aquaculture[J].Reviews in Aquaculture，2019，11（3）：907-924.

[24] THAMIZHVNAN S，NAFEEZ AHMED A，VINOTH KUMAR D，et al.Silencing of prophenoloxidase （proPO） gene in freshwater prawn， Macrobrachium rosenbergii， makes them susceptible to white spot syndrome virus （WSSV）[J].Journal of Fish Diseases，2020，44（5）：573-584.

[25] 丁鑒锋，温嫱，霍忠明，等.菲律宾蛤仔橙蛤、斑马蛤和白蛤群体酚氧化酶活性的比较研究[J].大连海洋大学学报，2018，33（5）：558-563.

[26] 韩珂珂.克氏原螯虾三个免疫相关基因Caspase-3C、Lectin和LGBP的功能研究[D].南京：南京师范大学，2019.

[27] ZHENG Z，AWEYA J J，BAO S，et al.The microbial composition of penaeid shrimps’ hepatopancreas is modulated by hemocyanin[J].The Journal of Immunology，2021，207（11）：2733-2743.

[28] ZHANG Y，WANG S，XU A，et al.Affinity proteomic approach for identification of an IgA-like protein in Litopenaeus vannamei and study on its agglutination characterization[J].Journal of Proteome Research，2006，5（4）：815-821.

[29] NESTEROVA N V，ZAGORODNYA S D，MOSHTANSKA V，et al.Antiviral activity of hemocyanin isolated from marine snail Rapana venosa[J].Antiviral Research，2011，90（2）：A38.

[30] TADESE D，SUN C，LIU B，et al.Synergetic effects of Clostridium butyricum and emodin on antioxidant capacities and immune-related gene expression of the giant freshwater prawns （Macrobrachium rosenbergii） under ammonia stress[J].Aquaculture Research，2021，52（2）：2424-2434.

[31] CASILLAS-HERNNDEZ R，GONZALEZ- GALAVIZ J R，RODRIGUEZ-ANAYA L Z，et al.Dietary use of methionine sources and Bacillus amyloliquefaciens CECT 5940 influences growth performance， hepatopancreatic histology， digestion， immunity， and digestive microbiota of Litopenaeus vannamei fed reduced fishmeal diets[J].Animals，2022，13（1）：43.

[32] 翟双双.肠道黏膜屏障机能及其调控研究进展[J].现代畜牧兽医，2014，308（7）：54-58.

[33] HAMIDOGHLI A，LEE Y，HWANG S，et al.Evaluation of yeast hydrolysate in a low-fishmeal diet for whiteleg shrimp （Litopenaeus vannamei）[J].Animals，2023，13（11）：1877.

[34] DUAN Y，ZHANG Y，DONG H，et al.Effect of the dietary probiotic Clostridium butyricum on growth， intestine antioxidant capacity and resistance to high temperature stress in kuruma shrimp Marsupenaeus japonicus[J].Journal of Thermal Biology，2017，66：93-100.

[35] HILLMAN E T，LU H，YAO T，et al.Microbial ecology along the gastrointestinal tract[J].Microbes and Environments，2017，32（4）：300-313.

[36] JANDHYALA S M，TALUKDAR R，SUBRAMANYAM C，et al.Role of the normal gut microbiota[J].World Journal of Gastroenterology，2015，21（29）：8787-8803.

[37] COLLADO M C，MERILUOTO J，SALMINEN S.Role of commercial probiotic strains against human pathogen adhesion to intestinal mucus[J].Letters in Applied Microbiology，2010，45（4）：454-460.

[38] 茹媛媛.乳酸乳球菌影響红螯螯虾生长和免疫性能及其肠道菌群的研究[D].泰安：山东农业大学，2021.

[39] FAN Y， WANG X L，WANG Y H，et al.Effect of dietary Bacillus licheniformis on growth， intestinal health， and resistance to nitrite stress in Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei[J].Aquaculture International，2021，29：2555-2573.

[40] AZAD M A K，ISLAM S S，SITHI I N，et al.Effect of probiotics on immune competence of giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii[J].Aquaculture Research，2018，50（7）：644-657.

Advances in research on immunoregulation of probiotics on shrimp and shellfish

WANG Xiao1，2， WU Hengmei2， XIAN Jianan1， LU Yaopeng1

（1. Institute of Tropical Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Key Laboratory of Research and Utilization of Functional Components of Marine Biological Resources in Hainan Province / Key Laboratory of Protection and Utilization of Tropical Agricultural Biological Resources of Hainan Province， Hainan Academy of Tropical Agricultural Resources， Haikou 571101， China; 2. School of Life Sciences， Jiamusi University， Jiamusi 154002， China）

Abstract：The regulatory effects of probiotics on the antioxidant capacity， immune function and intestinal barrier of shrimp and shellfish were reviewed， the mechanisms of common probiotics on the regulation of biological functions of shrimp and shellfish were introduced， and the direction of the development of probiotic research was prospected.

Key words：probiotics; immunity; shrimp; shellfish; mechanism