三种酶解蛋白肽分别替代部分鱼粉对凡纳滨对虾幼虾生长、体组成和抗氧化性能的影响

鲍清华 夏辉 杨煜洁 黄小容

摘 要：为研究使用低值动物酶解蛋白替代部分鱼粉对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）生长、体组成和抗氧化性能的影响，以初始体重为（0.05±0.01）g的凡纳滨对虾为研究对象，进行为期8周的养殖试验，未替代鱼粉组为对照组，用5%的鱿鱼肽、鱼肽和鸡肽分别替代饲料中的鱼粉为替代组，配制4种等氮等脂饲料。结果表明：鱿鱼肽组和鱼肽组与对照组相比特定生长率显著提高，而鸡肽组无显著差异，与对照组相比仅鱿鱼肽组粗蛋白含量显著增加，各替代组的粗脂肪含量均显著升高。各替代组肝胰腺T-AOC活性均显著上升。与对照组相比，鱿鱼肽组SOD、GSH-Px和CAT的活性均显著上升，而鱼肽和鸡肽组均未显著上升，各替代组血淋巴和肝胰腺中MDA含量均显著下降，鱿鱼肽组上调了Nrf2基因表达和HO-1基因表达，下调了Keap1基因表达。综上所述，鱿鱼肽和鱼肽对凡纳滨对虾幼虾的生长性能都有着显著的促进作用，但在提高对虾的营养水平，促进抗氧化基因的表达，减少抗氧化过程对机体内细胞的损伤方面，鱿鱼肽效果更佳。

关键词：凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）；酶解蛋白；生长性能；抗氧化性能

凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）是我国对虾主导养殖品种，养殖产量呈现逐年递增的趋势，2022年养殖产量达到209.87万t，比2021年增长了12.99%[1]。随着凡纳滨对虾养殖规模的增加，对虾饲料需求量增加，鱼粉的需求量也随之飙升。然而，鱼粉受海洋捕捞量、极端天气以及海洋环境等多方面因素的影响，出现了供求关系失衡的状况。目前，寻求价格低廉、来源广泛、以及对生态环境没有负影响的鱼粉替代蛋白源已成为当务之急。

现阶段，利用低值动物蛋白酶解后的产品替代鱼粉成为解决鱼粉短缺问题极具经济价值的方式。Zhou等[2]研究表明在低值饲料中添加3%的鱿鱼水解物增加了对虾的摄食量，降低了鱼粉使用量，节约了饲料成本，对生长性能未表现负面影响。低值蛋白经过酶解后，蛋白质以游离氨基酸、小肽和寡肽的形式存在，由于动物机体对小肽和寡肽的吸收效率远远高于氨基酸，因此酶解后的蛋白对生长具有促进作用。此外，酶解动物蛋白除了为水产动物提供营养外，还兼具其他功能特性，在黄颡鱼、凡纳滨对虾、美洲黑石斑幼鱼和大菱鲆幼鱼等研究中表明，酶解蛋白能够提高水产动物生长性能、抗氧化性能和诱食效果等[3-6]。Hlordzi[7]研究表明，水解鱼蛋白粉替代鱼粉对凡纳滨对虾的增重率、特定生长率和体组成等生长性能有积极影响。在水解鱿鱼内脏投喂真鲷鱼的研究表明，水解鱿鱼内脏促进了真鲷鱼的消化能力和摄食量，显著提高真鯛鱼的生长性能[8]。

目前，有关酶解动物蛋白对水产动物的生长性能和抗氧化性能影响的研究很多，但是饲料中鱿鱼肽、鱼肽和鸡肽分别替代部分鱼粉对凡纳滨对虾幼虾影响的对比研究未见报道。本研究针对当前状况，在饲料中添加三种不同酶解动物蛋白肽对凡纳滨对虾幼虾生长、体组成以及抗氧化性能进行了研究，为酶解蛋白在凡纳滨对虾幼虾饲料中的开发利用提供一定的实验数据和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

试验中使用的原料有鱼粉、豆粕、面粉、血粉、鱼油、豆油及添加剂，根据饲料配方（见表1）制作4组等氮等脂等能试验饲料：在本研究中，以鱼粉含量25%的基础饲料为对照组，分别以5%酶解鱿鱼膏（鱿鱼肽组）、酶解鳕鱼排（鱼肽组）和酶解鸡架（鸡肽组）替代基础饲料中的鱼粉，制备3种饲料。原料粉碎过80目筛后按照配方混匀，用双螺杆挤条机挤压成粒径1.0 mm的饲料，置于烘箱60 ℃熟化30 min后，自然风干，-20 ℃冻存备用。

1.2 试验养殖管理

将购买同一批次的虾苗暂养7 d，然后选用大小均匀，体型健壮的虾苗进行分组，每组设置3个平行，每个水箱120尾虾苗，虾苗的初始平均体重为（0.05±0.001）g，试验用的水箱大小为0.12 m3，养殖试验周期为56 d。养殖期间，每天投喂5次，日投喂量控制在虾体重的6%～12%，每天换水2次，每次换水量为1/3。养殖期间不间断供氧，水中溶解氧含量＞6.0 mg/L，海水盐度为（30±1）‰，水温保持在27～28 ℃，pH值为7.5～8.5，氨氮＜0.2 mg/L，亚硝酸盐含量＜0.2 mg/L。

1.3 样品采集与分析

养殖试验56 d后，禁食24 h，测定全虾生长性能指标。每组随机抽取10尾，其中5尾用于全虾体成分分析，剩余5尾采集围心腔血淋巴，离心（4 ℃，4 000 r/min，10 min）取上清液；取血后置于冰盘上，解剖取出肝胰腺组织，保存于-80 ℃备用，用于测定酶活指标及总RNA的提取。

1.4 测定指标和方法

1.4.1 常规成分及体成分测定指标 水分测定用105 ℃烘干恒重法；粗蛋白含量用凯氏定氮法测定，粗脂肪用索氏抽提法测定，灰分用马弗炉550 ℃灼烧至恒重。

1.4.2 肝胰腺和血淋巴抗氧化指标 总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性以及丙二醛（MDA）的含量均采用南京建成生物科技有限公司的试剂盒测定，检测方法严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4.3 RNA分析和PCR荧光定量 提取肝胰腺组织的总RNA，并用生物分析仪和琼脂电泳法检测RNA完整性，用显微分光光度计测定RNA纯度和浓度，用荧光定量PCR检测和定量RNA特定序列，引物序列见表2，运行geNorm软件作内参优选，选出EF1-α作为最优内参，并计算各组基因相对表达量。

1.4.4 数据统计与分析 试验数据用SPSS 260分析软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），用Duncan′s均值多重比较法对试验结果差异显著性进行分析，差异显著时（P<005），用GraphPad 8.0作图。

2 结果

2.1 酶解蛋白替代鱼粉对凡纳滨对虾生长性能的影响

三种酶解蛋白替代鱼粉对凡纳滨对虾幼虾生长性能的影响见表3，鱿鱼肽组和鱼肽组的终末体重（FBW）、增重率（WGR）和特定生长率（SGR）与对照组相比均显著升高（P<0.05）；试验各组间饲料系数（FCR）、蛋白质效率（PER）、出肉率（MR）和肝体比（HBI）均无显著性差异（P>0.05）。

2.2 酶解蛋白替代鱼粉对凡纳滨对虾体成分的影响

由表4可知，全虾粗蛋白含量除鱿鱼组显著高于对照组外（P＜0.05），其他各组均显著降低（P＜0.05）；与对照组相比，替代组全虾粗脂肪均显著高于对照组（P＜0.05）；与其他组相比，仅鸡肽组全虾灰分含量显著升高（P＜0.05）；全虾水分含量各组间均无显著性差异（P>0.05）。

2.3 酶解蛋白替代鱼粉对凡纳滨对虾幼虾抗氧化及相关基因表达的影响

由图1可知，3个替代组肝胰腺中T-AOC活性均显著高于对照组，但鱿鱼肽组更明显（P＜0.05），而在血淋巴中只有鱿鱼肽组T-AOC活性显著高于对照组，其他替代组并没有观察到显著差异（P＞0.05）。由图2可知，在肝脏中，鱿鱼肽组的SOD和GSH-PX的活性与对照组相比均显著升高（P＜0.05），而CAT的活性除鱿鱼肽组与对照组相比没有显著性差异外（P＞0.05），其他各组间CAT活性均显著下降（P＜0.05），试验各组间MDA含量与对照相比均显著下降（P＜0.05）；在血淋巴中，与对照组相比，CAT的活性鱿鱼肽显著上升（P＜0.05），鸡肽组显著下降（P＜0.05），而鱼肽组没有差异（P＞0.05）。所有试驗组血淋巴的MDA含量均表现出显著下降（P＜0.05）。由图3可知，鱿鱼肽组中Nrf2基因表达与对照组相比显著上调，而其他试验组中Nrf2基因表达显著下降。在试验各组中，Keap1基因表达均显著下降（P＞0.05）。此外，Nrf2基因表达与Keap1基因表达的相对量呈负相关关系。鱿鱼肽组HO-1基因表达与对照组相比显著上调（P＜0.05），其他各组间HO-1基因表达与对照组相比均没有显著性差异（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 三种酶解蛋白分别替代部分鱼粉对凡纳滨对虾生长的影响

本研究生长结果表明，鱿鱼肽组和鱼肽组凡纳滨对虾幼虾的生长性能显著提高，鸡肽组与基础组无显著性差异。鱿鱼本身具有强烈的芳香鱼腥味，添加到饲料中能够起到诱食剂的作用，因此能够提高生物的摄食率，增强其生长性能。已有研究表明，酶解鱿鱼内脏粉或鱿鱼膏添加到饲料中，对提高凡纳滨对虾、中华鳖和真鲷鱼的摄食性能和生长性能均有显著影响[9-11]。吕斌等[3]的研究表明，酶解鱿鱼内脏粉中含有的丰富游离氨基酸、小肽、牛磺酸以及其他营养因子，饲料中酶解鱿鱼内脏粉替代3%的鱼粉，可以显著提高黄颡鱼的摄食率，促进其生长性能的提升。酶解蛋白肽中的小肽或寡肽被转运进入小肠黏膜的吸收细胞，在肠黏膜相应的小肽载体作用下直接进入血液循环系统。由于小肽间的吸收是相互独立，因此小肽或寡肽能够快速地被生物机体吸收利用，促进生物机体的蛋白质代谢，进而提高其生长性能。Hlordzi等[12]的研究表明，水解鱼副产物中的小肽更易于被肠细胞吸收，当替代4%的鱼粉时，显著提高了对虾生长性能。在对克林雷式鲇（Rhamdia quelen）的研究中显示，饲料中添加水解鱼蛋白提高了其生长性能，鱼蛋白水解物含有丰富的氨基酸和营养物质，可以增加鱼类的摄食率，并促进其生长和发育[13]。目前，也有研究表明，酶解鸡浆或酶解家禽副产物对大口黑鲈和凡纳滨对虾的生长无促进作用[14-15]。Hlordzi[7]研究表明，酶解鸡肉浆对凡纳滨对虾的生长性能没有明显影响。该结论与本研究中鸡肽组对凡纳滨对虾幼虾的生长性能无显著影响基本一致。酶解蛋白肽中的小肽或寡肽能够快速地被生物机体吸收利用，酶解物小肽的快速吸收特性能够促进生物体的蛋白质代谢，提高其生长性能。然而，还需要进一步的研究来探索小肽或寡肽的特性和作用机制。此外，从本研究结果看，鱿鱼肽组和鱼肽组促生长效果要优于鸡肽组，这可能是三种酶解动物蛋白肽中的小肽分子量分布和游离氨基酸的含量差异，以及鱿鱼肽和鱼肽所具有的诱食性能所致。因此下一步还需要对三种酶解动物蛋白肽中小肽、寡肽及氨基酸的分布情况进行更深入的研究和探讨。

3.2 三种酶解蛋白分别替代部分鱼粉对凡纳滨对虾体成分的影响

高质量的蛋白源能够提高生物机体消化吸收利用率，促进机体生长和组织更新[16]。本研究中鱿鱼肽组的全虾粗蛋白含量显著高于其他组。王宁等[17]研究表明，添加鱿鱼组，促进全虾粗蛋白质的合成，提高了凡纳滨对虾粗蛋白含量，效果优于酶解鱼浆和酶解虾浆组，可能是鱿鱼组饲料中组胺含量更低，显著提高了凡纳滨对虾肠道酶蛋白活性。鱿鱼肽中高蛋白源营养物质，能够更好地提高凡纳滨对虾幼虾的消化吸收利用率，并增加其全虾粗蛋白含量。本研究发现，鸡肽组的全虾粗蛋白含量与对照组相比显著降低，而灰分含量则显著升高。这表明凡纳滨对虾幼虾对鸡肽的吸收利用率较低，可能导致全虾粗蛋白含量的下降。三种酶解蛋白中小肽或氨基酸营养成分含量存在差异，可能是导致吸收利用率不同的一个原因。然而，具体的机制仍需要进一步的研究来探索。

本研究中三个替代组全虾粗脂肪含量均显著高于对照组。肝体比通常可以作为肝脏脂肪或糖原蓄积的表观指标，但饲料中添加酶解蛋白均未对凡纳滨对虾幼虾的肝体比造成显著的影响，推测可能是对虾体内脂肪含量的增加并不足以引起脂肪在肝脏中沉积。吕斌等[18]研究表明，随着饲料中酶解溶浆粉（鱼、鱿鱼）添加水平的增加，黄颡鱼的粗脂肪含量呈现逐渐下降的趋势，添加过高水平的酶解溶浆粉，影响黄颡鱼肠道对营养物的吸收利用率，因吸收的营养物质不平衡导致生长发育受阻，增加了脂肪消耗的速率，鱼体粗脂肪含量下降。王铵静等[19]研究发现2%～3%酶解蛋白能显著降低凡纳滨对虾幼虾肌肉粗脂肪含量。Li等[20]研究表明，添加小肽会显著增加大口黑鲈肌肉粗蛋白与粗脂肪含量。根据本研究的生长性能以及肝体比等生长指标分析，三种不同酶解肽能够满足其正常生长的营养需要，生长发育中脂肪累积速率大于脂肪消耗速率，因此，鱿鱼肽组的脂肪利用要优于鱼肽和鸡肽组。

3.3 三种酶解蛋白分别替代部分鱼粉对凡纳滨对虾抗氧化及相关基因表达的影响

总抗氧化能力（T-AOC）水平的高低反映了机体防御系统抗氧化能力的综合性指标[21]。Keap1-Nrf2介导氧化还原反应体系，是生物机体内源性抗氧化信号通路的重要组成部分[22]。Nrf2是一种氧化还原敏感转录因子，主要功能是调节细胞保护的基因。Keap1负向调节Nrf2的功能，Keap1-Nrf2信号通路可激活调控机体内一些抗氧化酶和蛋白质的表达和转录，并参与炎症、肿瘤、细胞凋亡、细胞自噬和病毒感染等过程[23]。当生物机体发生氧化应激时，激活了Nrf2调控的下游靶基因包括SOD、GSH-Px、HO-1、CAT等基因的表达[24]。SOD、CAT和GSH-Px是酶促抗氧化防御系统的基本成分，它们共同参与机体氧化损伤的防御，其活性与生物机体免疫性能和外界环境胁迫有关[25]。MDA是脂质过氧化反应的终产物，是氧化损伤的重要标志物。HO-1血红素氧合酶1（Heme Oxygenase-1）是Nrf2主要依赖性基因，HO-1能够抵御机体氧化应激产生的过氧化物和超氧化物自由基对机体的损伤，在抗氧化防御和细胞凋亡预防中起重要作用[24]。本研究结果表明，鱿鱼肽的总抗氧化能力显著上升，上调了凡纳滨对虾Nrf2基因表达，激活后的Nrf2调控下游靶基因SOD、GSH-Px、HO-1和CAT的表达显著上升，下调Keap1基因表达，降低了MDA的含量，抑制了幼虾机体细胞损伤，而鱼肽和鸡肽组虽然总抗氧化能力显著上升，但是下调了Nrf2和Keap1基因表达。Jiang等[26]研究表明，鱿鱼肽中的小分子活性肽对自由基清除能力，以及增强抗氧化活性起着至关重要的作用，小分子活性肽可以作为生物食物中的抗氧化剂，具有抗氧化性、非特异性免疫和抗菌性。Suárez-Jiménez等[27]研究表明，水解鱿鱼副产物具有抗氧化、抗突变和抗增殖活性，水解后的鱿鱼副产物的抗氧化性增强是由于水解后产生的肽含有电子供体，这些电子供体更容易与自由基发生反应，将它们转化为更为稳定的产物，从而终止自由基链式反应。凡纳滨对虾的研究表明，当饲料中添加5%的鱿鱼膏和1.5%的鱼油时，可以增强肝胰腺中SOD的活性，清除凡纳滨对虾体内过多的自由基，保护肝胰腺细胞免受毒害，同时也提高了CAT的活性，降低了MDA活性以及机体细胞应激反应带来的损伤，增强机体吞噬细胞的防御能力，进而提高其抗病力，促进其健康生长[28]。本研究说明鱿鱼肽在调节Nrf2信号通路中的潜在作用机制，通过上调Nrf2基因的表达，调控抗氧化防御系统，降低Keap1基因的表达，鱿鱼肽有助于增强机体的抗氧化能力，减轻由氧化应激引起的细胞损伤。然而，鱼肽和鸡肽组展示了对Nrf2和Keap1基因表达不同的调节效果。可能说明鱿鱼肽中小肽物质有助于防止凡纳滨对虾发生脂质过氧化，从而降低了MDA的含量，减少对细胞的氧化毒性损伤。它们对于增强生物体的抗氧化能力的重要作用，特别是鱿鱼肽中的小分子活性肽在清除自由基、增强抗氧化活性等方面具有重要的功能，是一种有潜力的抗氧化剂。然而，需要进一步探究鱿鱼肽中小肽的特性和效果，以及其抗氧化方面的应用潜力。

未来的研究可以探讨不同酶解蛋白中的营养成分对Nrf2信号通路的调节作用以及调控下游抗氧化防御系统，更进一步探索细胞氧化应激反应和氧化还原平衡调节的分子机制，为开发水产养殖中新的酶解蛋白源提供理论支持。

4 结论

通过对凡纳滨对虾幼虾生长、体组成、抗氧化能力以及相关基因表达的影响分析，研究结果表明鱿鱼肽组在促进凡纳滨对虾的生长、改善体组成、增强抗氧化能力以及调节相关基因表达等方面表现出最佳效果。其次是鱼肽，虽然其效果略逊于鱿鱼肽组，但仍然对凡纳滨对虾的生长和健康发育产生了积极影响，这为水产养殖业饲料中添加鱿鱼肽、鱼肽和鸡肽等肽类饲料添加剂的使用提供重要参考数据。

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Effects of three enzymatic protein peptides replacing fishmeal on growth，body composition and antioxidant properties of juvenile Litopenaeus vannamei

BAO Qinghua， XIA Hui， YANG Yujie， HUANG Xiaorong

（College of Oceanography，Hebei Agricultural University，Qinhaungdao 066000，China）

Abstract：To understand the effects of replacing fish meal with low-value animal enzymatic protein on the growth， body composition， and antioxidant performance of Litopenaeus vannamei， L.vannamei were used as the research subjects with the initial weight of 0.05 ± 0.01 g for 8 weeks. The group which fish meal was not replaced served as the control group. The fish meal was replaced respectively with 5% of the squid peptide， fish peptide and chicken peptide in the replacement groups. Four types of equi-protein and equi-fat feeds were formulated.The results showed as follows： special growth rate of the the squid peptide group and the fish peptide group were significantly higher than the control group. the crude protein content of the squid peptide group was significantly higher than the control group in the body composition， the crude fat content was significantly higher in all substitution groups than the control group. The hepatic and pancreatic T-AOC activities significantly increased in all three enzymatic peptide groups compared to the control group. The activities of SOD， GSH-Px and CAT increased significantly in the squid peptide compared to the control group， while no significant difference were observed in fish peptide and chicken peptide groups， the content of MDA in all substitution sroups decreased significantly in hemolymph and hepatopancreas. The Nrf2 gene and HO-1 gene expression were up-regulated significantly， and the Keap1 gene expression was down-regulated significantly in squid peptide group. In conclusion， the growth performance of L.vannamei was significantly promoted in the squid peptide group and fish peptide group， but the squid peptide was better than the other groups，in improving the nutritional level of shrimp， promoting the antioxidant genes expression and reducing the damage to cells in the body during antioxidant process.

Key words：Litopenaeus vannamei; enzymatic hydrolysis protein; growth performance; antioxidant properties