基于BSA-seq技术对乌拉尔图小麦条锈病抗病基因的初步定位

倪楠楠, 杨小妮, 赵建辉, 李子玥, 乔柳惠, 李广伟, 王道文, 王换

(河南农业大学农学院/省部共建小麦玉米作物学国家重点实验室,河南 郑州 450046)

小麦是世界和中国最重要的粮食作物之一,全世界种植面积仅次于玉米和水稻,为世界上大约35%的人口提供口粮[1-2]。条锈病是由条形柄锈菌(Pucciniastriiformisf. sp.tritici)引起,影响小麦生长的最严重病害之一。条锈病的侵染和流行可导致小麦产量与品质的大幅度降低。每年条锈病的侵染和流行都会导致小麦大量减产,在大部分小麦生产地能导致减产10%～70%,如果发病较早且持续感染时间长,甚至减产100%[3-4]。由于条锈病发病区域的扩大和产量损失的增加,小麦条锈病已成为所有作物锈病中最严重的病害[5]。条锈菌适宜生活在低温、高湿的气候条件下,通常认为小麦条锈病主要发生在温带地区及热带地区的高海拔区域[6-7],但是在更温暖的地区也发生过多次毁灭性的流行爆发[8]。现在世界范围内88%的小麦栽培品种对条锈病易感,每年条锈病造成的小麦产量损失平均为547万t,相当于每年损失9.79亿美元[5]。而且,随着全球气候变异的加剧,条锈病流行的区域在不断扩大,造成的损失越来越多[5]。

种植条锈病抗性小麦品种是防治条锈病非常有效的、经济节约的并且环境友好的措施[9]。迄今为止,已有80多个小麦条锈病抗病位点被定位[10],但是只有少数基因被克隆,分别是Yr5、Yr7、YrSP、Yr10、Yr15、Yr18/Lr34、Yr36、Yr46、YrAS2388和YrU1。其中,Yr18/Lr34编码1个多效耐药亚家族的ABC转座子(adenosine triphosphate-binding cassette transporters)[11]、Yr36编码1个由激酶结构域和START脂结合结构域(kinase-start)组成的蛋白[3]、Yr46/Lr67编码1个己糖转运蛋白(hexose transporter)[12],Yr15编码1个具有2个类激酶结构域的蛋白[13]。这些抗病基因编码不同的蛋白家族蛋白,具有广谱和持久的抗病性。与之相反,Yr10编码1个典型的CC-NBS-LRR蛋白[14-15],YrAS2388编码1个NLR蛋白[16],Yr5,Yr7和YrSP是1个基因簇,编码N-端连接1个BED结构域的NLR蛋白[17],YrU1编码1个特殊的CC-NBS-LRR蛋白,在其N-端含有ANK结构域,C-端含有WRKY结构域[18],这些基因在小麦全生育期都具有抗性,是小种专化抗性基因,在小麦和条锈菌的共同进化过程中,容易被病原菌克服,从而丧失对条锈病的抗性[5,19],现已出现对Yr10具有毒性的条锈菌生理小种[4]。因此,为了小麦抗条锈病品种培育,需要定位和克隆发掘更多的条锈病抗病基因,为更好地培育具有持久稳定条锈病抗性的小麦品种提供基因资源和理论基础。本研究通过正向遗传学和BSA-seq技术结合的方法,从乌拉尔图小麦中快速定位1个新的小麦条锈病抗病基因位点,初步定位在7AS染色体的35 Mb的物理区间,在该区间尚未有报道条锈病抗病基因位点。该研究为抗病基因的精细定位和克隆提供研究基础,为小麦条锈病抗病育种提供理论指导和优异的遗传基因资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

乌拉尔图小麦材料TuW1、TuW2、TuW3、TuW4和PI428309原产地为黎巴嫩,TuW5和TuW6原产地为叙利亚,G1812原产地为土耳其。这些乌拉尔图小麦材料保存在河南农业大学农学院基因组学与分子育种中心实验室。PI428309为YrU1基因克隆的抗性亲本,G1812的基因组序列已经发表[20]。条锈病抗病基因的克隆群体由抗病亲本TuW1和TuW2与感病亲本G1812进行杂交获得。六倍体小麦品种铭贤169用来保持和扩繁条锈菌CYR34。

1.2 试验方法

1.2.1 条锈病接种及表型鉴定 本试验中接种用的条锈菌生理小种是CYR34,在六倍体小麦铭贤169上进行繁殖。收取在铭贤169上生长14 d的夏孢子与滑石粉(体积比1∶2)进行混合,用于后续接种试验材料。选取一叶一心期小麦材料,先在叶片上喷洒质量分数0.05% Tween 20后,将准备好的夏孢子均匀置在小麦叶片上,再喷洒0.05% Tween 20,然后将接种过的材料放置在10 ℃,100%湿度,黑暗培养24 h后,转移到16 ℃,光照时间16 h的温室中培养14 d后观察表型及后续试验[18]。条锈病侵染级别(infection types,IT)分为6个等级(分别为0、0;、1、2、3和4)。(IT 0): 免疫,在叶片上没有夏孢子和细胞坏死产生;(IT 0;):近免疫,叶片上没有夏孢子产生,但有细胞坏死产生;(IT 1):高抗,叶片上有少量夏孢子产生并伴随细胞坏死;(IT 2):中抗,叶片有比较多的夏孢子产生并伴有细胞坏死;(IT 3):中感,叶片有大量夏孢子堆并伴有叶片变黄,但没有细胞坏死。(IT 4):高感,叶片有大量夏孢子堆且没有细胞坏死和变黄[18-21]。

1.2.2 荧光显微镜组织观察 为了进行条锈菌的组织学观察,在接种条锈菌CYR34后的不同时间点剪取叶片并进行WGA-FITC染色[18,22-23]。接种叶片剪成2 cm的长度,放入5 mL KOH(1 mol·L-1KOH,加入0.05% sillwet L-77)溶液中,12 h后倒掉KOH溶液,用10 mL Tris-HCl(50 mmol·L-1, pH值7.5)的溶液清洗后倒掉,然后加入10 mL Tris-HCl(50 mmol·L-1, pH值7.5)溶液,20 min后倒掉Tris-HCl溶液,加入5 mL WGA-FITC(20 mg·L-1)溶液进行染色,15 min后,用Tris-HCl(50 mmol·L-1, pH值7.5)进行清洗,清洗后的小麦叶片在荧光显微镜下进行观察并拍照。

1.2.3YrU1分子标记鉴定 由于已在乌拉尔图小麦中克隆了条锈病抗病基因YrU1,需要鉴定新的乌拉尔图抗病材料的条锈病抗性是否由YrU1介导,本研究通过PCR方法,采用已发表的YrU1的分子标记进行鉴定[18]。

1.2.4 乌拉尔图小麦中条锈病抗病基因的BSA-seq分析 (1)定位群体构建:以G1812为母本,TuW1和TuW2分别为父本杂交,获得F1种子,在河南农业大学原阳基地播种,收获F2代群体,在温室进行苗期条锈病抗性鉴定以及遗传分析。

(2)G1812/TuW1杂交群体混池构建:15株G1812植株和15株TuW1植株为亲本混池,F2代群体接种条锈菌CYR34后,抗病和感病的植株各取30株为子代混池,提取DNA后等摩尔混合构建2个亲本文库和2个子代文库,送到北京贝瑞和康生物技术有限公司进行测序分析。

(3)BSA-seq数据处理分析:高通量测序得到的数据首先进行SNP、Indel位点统计,利用最小覆盖的reads数目为4、缺失率为0、最小比对质量为40和只保留双等位变异等参数对变异位点进行过滤。随后,在全基因组水平,以1 Mb大小为窗口,100 kb大小为步长,分别比较抗病混池和感病混池中抗病亲本的等位基因频率差值(Deta index=RpoolR-SpoolR),鉴定抗病基因位点。

2 结果与分析

2.1 乌拉尔图小麦材料的条锈病抗性鉴定

为了在乌拉尔图小麦中鉴定新的条锈病抗病基因,通过苗期温室接种鉴定了大量河南农业大学农学院基因组学与分子育种中心实验室保存的乌拉尔图小麦材料对条锈菌CYR34的抗性。基因组序列已经公布的G1812材料[20],在接种14 d后,叶片表面有大量的夏孢子堆且没有细胞坏死和叶片变黄(图1)。与之相反,鉴定到了7个对条锈菌CYR34具有抗性的乌拉尔图小麦材料(图1),其中PI428309是克隆YrU1的亲本材料,材料TuW2、TuW3、TuW4和TuW5侵染级别(IT 0;)接近免疫,叶片上没有夏孢子产生,但有细胞坏死产生,TuW1、TuW6和PI428309侵染级别(IT 1)高抗,叶片上有少量夏孢子产生并伴随细胞坏死。

图1 乌拉尔图小麦材料的条锈病抗性鉴定Fig.1 Resistance identification to stripe rust of Triticum urartu accessions

2.2 不同乌拉尔图小麦材料中YrU1分子标记鉴定

为了鉴定筛选到的抗病乌拉尔图小麦材料的抗病性是否由YrU1基因控制,通过PCR方法,采用已发表的YrU1基因分子标记进行鉴定。结果如图2所示,在PI428309材料中,YrU1基因分子标记能扩增出约1 300 bp的片段,而在筛选到的7个抗病材料中,除了TuW6能扩增出YrU1基因片段,其余6份抗病材料中均不存在YrU1基因,可以作为亲本来克隆新的条锈病抗病基因。

M:DNA分子量标准。TuW1、TuW2、TuW3、TuW4、TuW5、TuW6和PI428309为抗病材料,G1812为感病对照材料,红色“*”处为YrU1分子标记扩增片段。

2.3 乌拉尔图小麦材料TuW1和TuW2对条锈菌CYR34的抗性鉴定

为了验证TuW1和TuW2这2个材料对条锈菌CYR34的抗性,对这2个材料接种条锈菌CYR34后不同时间条锈菌的生长速度和侵染情况进行观察。一叶一心期的乌拉尔图小麦材料TuW1、TuW2和G1812接种CYR34,G1812作为感病对照材料,分别在接种后24、48、72、120 h,7 d取接种叶片进行WGA染色,然后在荧光显微镜下进行组织学观察,分别在24、48、72、120 h,7和14 d取接种叶片观察表型并拍照。在接菌24 h(图3-A)和48 h(图3-B)时,G1812、TuW1和TuW2均形成了气孔下囊(SSV),初生菌丝(PH),吸器母细胞(HMC),菌丝生长速度差别不明显;但是在接菌72 h(图3-C)时,TuW1和TuW2的条锈菌生长速度显著低于感病材料G1812;在接菌120 h(图3-D)和7 d(图3-E)时,TuW1和TuW2的条锈菌生长速度和侵染区域均显著低于感病材料G1812。在接菌24、48、72、120 h时,小麦叶片表型在TuW1、TuW2和感病材料G1812之间没有明显的差异,在叶片表面均未出现条锈菌夏孢子堆和细胞坏死;在接菌7 d时,G1812叶片表面未出现细胞坏死,与之相反,TuW1和TuW2叶片表面出现明显的细胞坏死;在接菌14 d时,G1812叶片表面形成大量的条锈菌夏孢子堆且未出现细胞坏死,表现为对条锈菌CYR34感病(IT 4),与之相对,TuW1和TuW2叶片表面均未形成条锈菌夏孢子堆且出现大片明显的细胞坏死,表现为对条锈菌CYR34抗病(IT 0;)。组织学观察和叶片表型结果都显示,TuW1和TuW2这2个材料具有对条锈菌CYR34的抗性,可以进行新的条锈病抗性基因克隆。

约10 d幼苗接种条锈菌CYR34 24 h (A),48 h (B),72 h (C),120 h(D),7 d (E)后条锈菌组织学观察。SSV:气孔下囊;PH:初生侵染菌丝; HMC:吸器母细胞;H:吸器。标尺:20 μm。

约10 d的G1812、TuW1和TuW2幼苗接种条锈菌CYR34,分别在接种后24 h(A)、48 h(B)、72 h(C)、120 h(D)、7 d(E)、14 d(F)取接种叶片进行表型观察和拍照。

2.4 乌拉尔图小麦材料TuW1和TuW2中抗条锈病位点的遗传分析

为了克隆新的条锈病抗病基因,分别将TuW1和TuW2与G1812进行杂交,获得F1和F2群体。将杂交后代G1812/TuW1 F1和G1812/TuW2 F1接种条锈菌CYR34,结果显示,接种14 d后,G1812/TuW1 F1和G1812/TuW2 F1植株叶片表面均形成大量的条锈菌夏孢子堆且未出现细胞坏死,表现为对条锈菌 CYR34感病(IT 4)(图5),猜测TuW1和TuW2中的条锈病抗性可能由隐性基因控制。

A:约10 d的G1812、TuW1和G1812/TuW1 F1代幼苗接种条锈菌CYR34,在接种后14 d取接种叶片进行表型观察和拍照。B:约10 d的G1812、TuW2和G1812/TuW2 F1代幼苗接种条锈菌CYR34,在接种后14 d取接种叶片进行表型观察和拍照。

G1812/TuW1 F2和G1812/TuW2 F2群体接种条锈菌CYR34,接种14 d后进行抗病表型观察并进行表型分型分析,结果显示,在G1812/TuW1 F2和G1812/TuW2 F2群体中发生表型分离(图6),且感病植株和抗病植株的分离比符合3∶1(表1),表明乌拉尔图小麦材料TuW1和TuW2对条锈菌CYR34的抗性由单一位点的隐性基因控制。

表1 G1812/TuW1 F2和G1812/TuW2 F2对条锈菌CYR34抗性的遗传分析Table 1 Genetic analysis of resistance to Pst CYR34 in F2 populations of G1812/TuW1 and G1812/TuW2

G1812/TuW1 F2植株抗病表型(IT) 分离为5个等级(分别为0;、1、2、3和4),其中IT为0;、1和2的为抗病,IT为3和4的为感病。

2.5 基于BSA-seq技术对乌拉尔图小麦材料中条锈病抗病基因的初步定位

为了定位新的条锈病抗病基因位点,构建了G1812和TuW1 2个亲本混池和G1812/TuW1 F2中抗病群体和感病群体两个子代混池,进行BSA-seq测序分析,高通量测序数据一共鉴定到25 418 131个SNP、Indel位点,然后利用最小覆盖的reads数目为4、缺失率为0、最小比对质量为40和只保留双等位变异等参数对变异位点进行过滤,一共得到15 365 146个高质量SNP位点(图7)。随后,在全基因组水平,以1 Mb大小为窗口,100 kb大小为步长,分别比较抗病混池和感病混池中抗病亲本的等位基因频率差值(Deta index=RpoolR-SpoolR)和比值(Ratio index=RpoolR/SpoolR)。利用这种方法,在7号染色体短臂端部0～35.2 Mb区间鉴定到1个抗病位点(表2,图8)。在抗病混池中,此位点上抗病亲本的等位基因频率为0.875;感病混池中,抗病亲本等位基因频率仅为0.083(表2)。推测此位点含有控制小麦条锈病的抗病基因。

表2 基于BSA-seq技术对乌拉尔图小麦条锈病抗病基因的区间定位Table 2 Gene interval mapping of stripe rust resistance gene loci based on BSA-seq technology in Triticum urartu

图7 抗感亲本间的变异位点在染色体上的分布Fig.7 Chromosome distribution of variation site between resistant and susceptible parents

图8 基于BSA-seq技术对乌拉尔图小麦条锈病抗病基因的定位Fig.8 Gene mapping of stripe rust resistance gene loci based on BSA-seq technology in Triticum urartu

3 讨论与结论

条锈病是影响小麦产量和品质的最严重病害之一,种植抗病品种小麦是防治条锈病最有效的策略之一。迄今为止,已有80多个条锈病抗性位点被鉴定,部分基因已被用于小麦条锈病抗病品种培育。由于条锈菌的不断进化以及长期种植某几种抗病品种,当地的优势生理小种发生变化,使得抗病品种在当地感病,抗条锈病位点丧失抗性,特别近些年流行的毒性小种CYR34,克服了抗病基因Yr26的抗性,使得大部分抗病小麦品种丧失了抗性。因此培育更多新的抗病品种成为必须,聚合品种和多系品种的培育尤为重要,需要发掘和克隆更多新的抗条锈病基因,为小麦育种提供新的遗传资源[9,24-25]。本研究定位了1个对条锈菌生理小种CYR34具有抗性的位点,为小麦抗病育种提供了新的基因资源。

由于小麦品种的单一化和种质的一致性,小麦抗病基因资源匮乏,需要发掘更多的抗病基因资源。小麦的近缘种属能够作为抗条锈病基因定位和克隆的良好抗源。已有部分小麦抗病基因在小麦的近源种属中克隆所得,如Yr36[3],Sr33[26],Sr50[27],Pm21[28],Lr42[29],Pm41[30],Pm69[31],Yr15[13]等,这些基因大部分已应用到当前的抗病品种中。乌拉尔图小麦是六倍体小麦的A亚基因组的祖先供体,已有报道在乌拉尔图小麦中克隆了条锈病抗性基因YrU1[18],白粉病抗病基因Pm60[32],这2个基因转移到普通小麦中同样具有抗病性,因此乌拉尔图小麦可以作为小麦抗病育种的良好抗源,本研究在乌拉尔图小麦中定位了1个新的条锈病抗病位点,该位点是一个不由YrU1控制的新的条锈病抗病基因位点,为小麦条锈病抗病育种提供新的遗传基因资源。

本研究对乌拉尔图小麦中的条锈病抗病基因进行遗传分析和初步定位。2个定位群体的分离结果表明,2个抗病材料(TuW1和TuW2)的条锈病抗病基因均是由1个隐性的单基因位点控制的,利用BSA-seq技术将乌拉尔图材料TuW1的条锈病抗病基因定位在7AS的0～35.2 Mb区间内。该结果为图位克隆该条锈病抗病基因及其在小麦抗病品种培育的应用提供了研究基础。