miR-152-3p表达下调降低紫杉醇耐药人卵巢癌细胞A2780T对紫杉醇的耐药性

张洋，赵辰戈，程荔春，吕慧怡，3，吴迪

（1.大连医科大学附属第二医院药学部，辽宁大连 116023；2.大连医科大学药学院，辽宁大连 116044；3.大连科翔生物科技有限公司，辽宁大连 116085）

卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，长期以来其死亡率位居妇科肿瘤首位［1］。化学疗法是治疗卵巢癌的首选手段，而化疗耐药是导致治疗失败的主要原因［2］。紫杉醇作为治疗卵巢癌的一线药物，发挥着不可或缺的作用，而耐药性的产生限制了其临床应用，其机制尚不明确［3］。

微RNA（microRNA，miRNA）是一组长度为21～25 个核苷酸的非编码RNA，通过与互补靶向信使RNA 结合而抑制或降解信使RNA 翻译［4］，在细胞分化、增殖和凋亡中发挥重要作用。研究报道，卵巢癌的发生发展与miRNA表达密切相关，miRNA可通过调控不同靶基因发挥抑癌或促癌作用［5-6］。例如，miR-212 和miR-31 在卵巢癌中低表达，可作为卵巢癌的标志基因［7-8］；miR-142-5p，miR-203 和miR-373通过靶基因影响卵巢癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭以及耐药性［9-11］。

近几年，miR-152 被较多关注，其与miR-148a和miR-148b共同构成miR-148/52家族［12］。miR-152功能复杂多样，与多种癌症的发生发展有关。据报道，胃癌中miR-152过表达可明显抑制癌细胞增殖并诱导其凋亡，抑制胃癌的发生发展［13］。miR-152-3p与卵巢癌发生亦密切相关。Li等［14］报道，miR-152-3p通过抑制酪氨酸激酶受体的编码基因人表皮生长因子受体3（ERBB3）表达参与卵巢癌细胞增殖和转移。He等［15］报道，早期生长反应因子1通过与自噬相关基因14（autophagy-related gene 14，ATG14）相互作用上调miR-152-3p 转录。ATG14是miR-152-3p调节自噬的功能靶基因，可抑制卵巢癌细胞增殖，并降低癌细胞对顺铂的耐药性。然而，miR-152-3p 对紫杉醇卵巢癌耐药细胞的影响尚未见报道。本研究探讨miR-152-3p对紫杉醇耐药卵巢癌细胞A2780T 耐药性的影响，以期为卵巢癌的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和主要仪器

人卵巢癌A2780和A2780T细胞购自上海美轩生物科技有限公司。总RNA 提取试剂Trizol、逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）试剂盒（中国TransGen Biotech公司）；MTT 试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技公司）；Annexin Ⅴ/PI细胞凋亡检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；miR-152-3p抑制物（上海吉玛制药有限公司）；兔抗人P 糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）抗体、兔抗人多药耐药相关蛋白1（multidrug resistance associated protein 1，MRP1）、兔抗人三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2（ATP-binding cassette G2，ABCG2）、兔抗人BCL2关联X蛋白（Bax）、兔抗人Bcl-2、兔抗人磷酸酯酶张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）、鼠抗人GAPDH单克隆抗体（一抗）（美国Abcam公司）；脂质体Lipo2000、胎牛血清、RPMI 1640 和辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔或鼠IgG 抗体（二抗）及miR-152-3p，U6，PTEN和GAPDH引物（表1）（美国Invitrogen 公司）。165-8001 电泳仪（美国BIO-RAD公司）和Countess®ⅡFL全自动细胞计数仪（美国Llfe Technologles 公司）；NanoDrop 2000超微量分光光度计（美国Thermo Scientific 公司）；Odyssey Dlx 双色红外激光扫描成像系统（美国LICOR公司）。

Tab.1 Primer sequences for real-time quantitative PCR（RT-qPCR）

1.2 细胞培养

A2780 和A2780T 细胞用RPMI 1640 培养基（含10%胎牛血清和1%青霉素和链霉素）于37 ℃，5% CO2和饱和湿度培养。A2780T 细胞用浓度为200 μg·L-1的紫杉醇培养以维持耐药性。实验前，A2780T 细胞弃药培养7 d，以避免药物毒性对实验结果的干扰，取对数生长期细胞进行实验。

1.3 MTT法检测细胞存活率

取对数生长期的A2780和A2780T细胞接种于96 孔板，每孔1×104细胞，加入不同浓度紫杉醇（1.875，3.75，7.5，17 和23 μmol·L-1），同时设空白对照组（无细胞）和细胞对照组（无药物），每组设3复孔。孵育48 h后加入MTT（5 g·L-1）50 μL继续孵育4 h，每孔加入二甲亚砜150 μL，于570 nm 处测定吸光度值（A570nm）。细胞存活率（%）=（实验组A570nm-空白对照组A570nm）/（细胞对照组A570nm-空白对照组A570nm）×100%。采用Graphpad Prism 8.2.1 软件计算IC50值，并计算耐药指数（resistance index，RI）。RI=A2780T细胞IC50/A2780细胞IC50。

1.4 miR-152-3p抑制物和PTEN siRNA转染A2780T细胞

用Lipo2000 对对数生长期的A2780T 进行瞬时转染，miR-152-3p 抑制物、PTEN siRNA 及其相应阴性对照序列见表2。细胞转染前1 d，细胞聚合度达90%，进行六孔板铺板。将A2780T 细胞以3.0×108·L-1均匀铺于六孔板，细胞聚合度达60%～70%时进行转染。首先，每孔用PBS 1 mL 清洗2 次，加入无双抗培养基1.5 mL。将miR-152-3p抑制物或PTEN siRNA 10 μL 及其相应阴性对照分别溶于250 μL无血清培养基中混匀，室温静置5 min；同时将Lipo2000 5 μL 溶于250 μL 无血清培养基中混匀，室温静置5 min。将2 种液体混匀，室温放置20 min；随后将混合液加入6 孔板中混匀，6 h 后将培养液换成含10%血清的完全培养基继续培养24 h 进行蛋白质提取、RNA 提取和流式细胞术测定。

Tab.2 Primer sequences of microRNA and small interfering RNA（siRNA）

1.5 Western 印迹法检测A2780T 和A2780 细胞多药耐药蛋白P-gp，MRP1 和ABCG2 表达水平及A2780T细胞凋亡蛋白Bax和Bcl-2表达水平

A2780、A2780T 和转染miR-152-3p 抑制物或PTEN siRNA 的A2780T 细胞培养24 h，弃培养液，用RIPA 裂解液和PMSF 于冰上充分裂解细胞，收集并离心获得细胞总蛋白。BCA 法测定蛋白质浓度并定量后予以蛋白变性，随后进行SDS-PAGE分离、湿法转膜、5%脱脂牛奶封闭（室温1 h）和一抗（抗P-gp，MRP1 和ABCG2 抗体：1∶5000；抗Bax和Bcl-2 抗体：1∶1000；抗PTEN 抗体：1∶2000；抗GAPDH 抗体：1∶10 000）4 ℃孵育过夜，次日用二抗（HRP 标记山羊抗兔或鼠IgG 抗体：1∶10 000）室温避光孵育1 h，Odyssey®Dlx 双色红外激光成像系统显影获取蛋白条带。采用Image J 软件对蛋白条带进行积分吸光度分析，以待测蛋白与内参蛋白GAPDH 条带的积分吸光度比值表示待测蛋白相对表达水平。

1.6 RT-qPCR检测A2780和A2780T细胞miR-152-3p和PTEN mRNA表达水平

待A2780和A2780T细胞聚合度＞90%，Trizol法提取细胞总RNA，逆转录为cDNA进行RT-qPCR，检测miR-152-3p 和PTENmRNA 水平。反应体系：cDNA 0.4 μL（2 μg），PCR 上下游引物各0.4 μL，SYBR GreenⅠ荧光染料混合物10.0 μL 和DEPC水8.8 μL。反应条件：95 ℃30 s；95℃5 s，60 ℃30 s，40 个循环。GAPDH或U6作为内参基因，待测基因表达水平用2-△△Ct表示。

1.7 划痕实验检测细胞迁移能力

培养转染miR-152-3p 的A2780T 细胞，待细胞贴壁时用200 μL 的无菌枪头在细胞贴壁部分划出一个“十”字型，PBS 洗掉脱落的细胞，倒置显微镜下拍照记录0 h细胞划痕宽度。继续培养24和48 h后，用PBS 洗掉漂浮的细胞，倒置显微镜下分别拍照，记录培养24 和48 h 细胞划痕宽度，计算细胞迁移面积。

1.8 流式细胞术检测A2780T细胞凋亡

转染miR-152-3p 抑制物的A2780T 细胞经不含EDTA 的胰蛋白酶消化后，用预冷PBS 洗涤2 次并重悬于500 μL预冷的结合缓冲液中，按细胞凋亡检测试剂盒说明书进行Annexin V-FITC 和碘化丙啶（PI）染色，通过流式细胞术分析细胞凋亡率（含早期和晚期凋亡率）。

1.9 在线数据库预测miR-152-3p的靶基因

利用基因数据库miRDB（V6.0，http：//www.mirdb.org），Targetscan（V7.2，http：//www.targetscan.org），miRWalk（V3.0，http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de）和Starbase（V3.0，http：//starbase.sysu.edu.cn）4 个在线预测工具，以“hsamiR-152-3p”为搜索词进行检索并进行数据处理，分别获取各软件预测到的靶基因；利用在线集合统计软件VENNY2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），取4 个预测软件预测得到的靶基因的交集。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 A2780T细胞紫杉醇耐药性的鉴定

MTT 法检测结果（图1A）表明，紫杉醇处理后A2780T 细胞存活率明显高于A2780 细胞（P＜0.01）；A2780T 细胞的IC50值为（3.4±0.6）mg·L-1，A2780细胞为（1.20±0.04）mg·L-1（P＜0.01）；A2780T细胞的耐药指数为2.8。Western 印迹法检测结果（图1B）表明，A2780T 细胞多药耐药蛋白P-gp，MDR1 和ABCG2 表达明显高于A2780 细胞（P＜0.01）；表明A2780T细胞对紫杉醇具有耐药性。

2.2 转染miR-152-3p抑制物对A2780T细胞增殖、迁移、凋亡及紫杉醇耐药的影响

RT-qPCR 检测结果表明，A2780T 细胞中miR-152-3p表达水平比A2780细胞高（43.0±6.3）倍（P＜0.01，图2A）。转染miR-152-3p 抑制物后，A2780T中miR-152-3p表达抑制率达97%（P＜0.01，图2B）。

划痕实验结果表明，转染miR-152-3p抑制物组A2780T 细胞培养24 和48 h 细胞迁移面积明显小于转染miR-152-3p 阴性对照组（P＜0.05，图2C），表明miR-152-3p 低表达可抑制A2780T 细胞的迁移能力。

MTT 法结果表明，转染miR-152-3p 抑制物组A2780T 细胞与紫杉醇1.875，3.75，7.5，17 和23 μmol·L-1孵育48 h，细胞存活率（P＜0.05，P＜0.01，图2D1）和IC50值（P＜0.05，图2D2）均明显低于转染miR-152-3p 阴性对照组，表明抑制miR-152-3p表达可降低A2780T细胞对紫杉醇的耐药性。

Fig.1 ldentification of paclitaxel（PTX）resistant cells A2780T.A：A2780 and A2780T cells were incubated with PTX 1.875，3.75，7.5，17 or 23 μmol·L-1 for 48 h.The cell viability was detected by MTT assay.Cell viability（%）=（A570 nm of experimental group-A570 nm of blank control group）/（A570 nm of cell control group-A570 nm of blank control group）×100%.B：the protein expressions of P-glycoprotein（P-gp），multidrug resistance gene 1（MDR1）and ATP-binding cassette G2（ABCG2）measured by Western blotting，B2 was the semi-quantitative result of B1.IA：integrated absorbance.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with A2780 cells.

Fig.2 Effect of transfecting miR-152-3p inhibitor on proliferation，migration and drug resistance in A2780T cells.A：expression level of miR-152-3p in A2780 and A2780T cells detected by RT-qPCR.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with A2780 cells.B：verification of knockdown efficiency of miR-152-3p in A2780T cells using RT-qPCR after transfecting miR-152-3p inhibitor for 24 h.The miR-152-3p inhibitor was transfected using a lipid-mediated transient transfection technique，while miR-152-3p negative control（miR-152-3p NC）group was simultaneously established.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with miR-152-3p NC group.C：the migration ability of A2780T cells detected by scratch after transfecting for 24 h，C2 was the quantitative result of C1.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with miR-152-3p NC group at the same time.D：the cell viability（D1）and IC50（D2）of transfected A2780T cells incubated with PTX for 48 h detected by MTT assay.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with miR-152-3p NC group.

流式细胞术检测结果显示，转染miR-152-3p 抑制物组A2780T细胞凋亡率明显高于转染miR-152-3p 阴性对照组（P＜0.05，图3A）。Western 印迹法结果表明，与转染miR-152-3p阴性对照组相比，转染miR-152-3p 抑制物组凋亡蛋白Bax 表达升高（P＜0.01），Bcl-2 表达降低（P＜0.05，图3B）；提示miR-152-3p低表达可促进A2780T细胞凋亡。

Fig.3 Effect of transfecting miR-152-3p inhibitor on apoptosis of A2780T cells.See Fig.2B for transfecting miR-152-3p inhibitor.A：apoptosis rate detected by flow cytometry，A2 was the quantitative result of A1.B：protein expressions of Bax and Bcl-2 measured by Western blotting，B2 was the semiquantitative result of B1.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with miR-152-3p NC group.

2.3 miR-152-3p 调控PTEN 参与A2780T 细胞对紫杉醇的耐药性

2.3.1 生物信息学预测miR-152-3p的靶向基因

利用基因数据库miRDB，Targetscan，miRWalk和Starbase 等4 个在线预测工具预测miR-152-3p的靶基因，共筛选出308 个基因（图4A）。结合PubMed 文献查阅，最终得到与卵巢癌相关的靶向基因PTEN。数据库分析显示，在卵巢癌中miR-152-3p 与PTEN的关系呈正相关（图4B），并且PTEN与miR-152-3p 有多个不同结合位点（图4C）。

Fig.4 Targeted genes for miR-152-3p predicted by bioinformatics.A：venn diagram intersection of prediction results of miR-152-3p in TargetScan，miRDB，miRWalk，and Starbase databases；B：PTEN was positively correlated with miR-152-3p showed by StarBase database；C：displayed consequential pairing of target region（top）and miRNA（bottom）and the binding site of the target sequence displayed through the TargetScan database.

2.3.2 miR-152-3p靶基因的验证

Western 印迹法进一步验证结果显示，转染miR-152-3p 抑制物后，与其阴性对照组相比，A2780T 细胞PTEN 表达显著降低（P＜0.05，图5A），表明A2780T细胞miR-152-3p表达下调的同时，PTEN 蛋白表达亦显著降低。用RT-qPCR 检测PTENmRNA 在A2780 和A2780T 细胞中的表达。结果显示，A2780T 细胞中PTENmRNA 表达亦明显高于A2780细胞（P＜0.01，图5B）。

Fig.5 Verification of target gene of miR-152-3p.A：the expression level of PTEN protein in transfected A2780T cells by Western blotting.See Fig.2B for transfecting miR-152-3p inhibitor.A2 was the semi-quantitative result of A1.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with miR-152-3p NC group.B：the expression level of PTEN mRNA in A2780 and A2780T cells detected by RT-qPCR.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with A2780 cells.

2.3.3 下调PTEN 表达降低A2780T 细胞对紫杉醇的耐药性

通过脂质体转染技术转染PTEN siRNA，沉默A2780T细胞中PTEN表达。结果显示，与转染siRNA阴性对照组相比，转染PTEN siRNA 组A2780T 细胞PTENmRNA 降低60%（P＜0.05，图6A）。MTT结果显示，转染PTEN siRNA组A2780T细胞存活率（P＜0.05，P＜0.01，图6B1）和IC50值（P＜0.01，图6B2）均降低。Western 印迹法检测结果显示，与转染siRNA阴性对照组相比，转染PTEN siRNA组A2780T细胞P-gp，MRP1 和ABCG2 蛋白表达水平均降低（P＜0.05，P＜0.01，图6C）。由此表明，下调PTEN表达可降低A2780T细胞对紫杉醇的耐药性。

Fig.6 Effect of transfecting PTEN siRNA on proliferation and drug resistance in A2780T cells.See Fig.2B for transfecting PTEN siRNA.A：transfection efficiency assessed using RT-qPCR after transfecting A2780T cells with PTEN siRNA for 24 h.B：the cell viability（B1）and IC50（B2）of transfected A2780T cells incubated with PTX for 48 h detected by MTT assay.C：protein expressions of P-gp，MRP1 and ABCG2 measured by Western blotting，C2 was the semi-quantitative result of C1.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with siRNA NC group.

3 讨论

卵巢癌是预后最为不良的妇科肿瘤，高死亡率是卵巢癌的标志性特征，主要原因是疾病复发和化疗耐药［16］。已有大量研究表明，miRNA是卵巢癌的标志性分子，可以通过调节多种信号通路影响卵巢癌细胞增殖、凋亡、迁移及耐药［17］，如miR-136 与人上皮卵巢癌的原发性顺铂耐药相关，miR-200c 和miR-141也被证实为卵巢癌的潜在诊断和预后生物标志物［18-20］。然而，miR-152-3p在紫杉醇耐药卵巢癌中的生物学功能和分子机制仍不清楚。

本研究观察了miR-152-3p 对A2780T 细胞紫杉醇耐药的作用。首先对A2780T细胞的紫杉醇耐药性进行了验证。结果表明，A2780T细胞耐药指数为2.8；且P-gp，MRP1和ABCG2蛋白表达均高于紫杉醇敏感细胞A2780，表明A2780T细胞对紫杉醇具有耐药性。随后用RT-qPCR 法检测了miR-152-3p在A2780T 和A2780 细胞中的表达。结果表明，A2780T细胞中miR-152-3p表达明显高于A2780 细胞，提示miR-152-3p 对A2780T 细胞耐药发挥作用。用脂质体瞬时转染技术转染miR-152-3p 抑制物降低A2780T 细胞中miR-152-3p 表达，结果发现，与转染miR-152-3p 阴性对照组比较，转染miR-152-3p抑制物后A2780T细胞存活率和细胞迁移能力明显降低，细胞凋亡率升高，且Bax 蛋白表达增加，Bcl-2 蛋白表达降低。上述结果表明，抑制miR-152-3p表达可抑制A2780T细胞增殖和迁移，促进细胞凋亡，降低A2780T细胞对紫杉醇的耐药性。

已有研究表明，miRNA 可与目的蛋白信使RNA 的3′UTR 端结合，导致目的基因信使RNA 裂解或降解，从而对目的基因进行转录后调控，抑制其表达［21］。虽然miRNA 被广泛认为负向调控下游靶基因，但也有来自体外实验的证据表明，miRNA也可以激活基因表达，如miR-93-5p 正向调控丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶2（MAP3K2）水平抑制肝癌细胞增殖、侵袭和迁移［22］；以鸟嘌呤序列结合因子1 介导的miR-G-10 正向调控磷脂酰肌醇-3-激酶调控亚基3水平激活蛋白激酶B/NF-κB信号通路抑制宫颈癌细胞迁移和侵袭［23］。据报道，心脏疾病、糖尿病和非小细胞肺癌等miR-152-3p 与PTEN 呈负向调控关系［24-26］。然而，在紫杉醇耐药卵巢癌细胞中miR-152-3p 与PTEN 的靶向关系未见报道。本研究用miRDB，Targetscan，miRWalk 和Starbase数据库预测miR-152-3p的靶基因。结果表明，PTEN是miR-152-3p的一个靶基因。用Western印迹法检测转染miR-152-3p 抑制物后A2780T 细胞PTEN 蛋白表达的变化及RT-PCR 检测A2780 和A2780T 细胞PTENmRNA 表达水平予以验证。结果表明，转染miR-152-3p 抑制物后A2780T 细胞PTEN 蛋白表达低于转染miR-152-3p阴性对照组，且A2780T细胞PTENmRNA表达水平高于A2780细胞。为此，用脂质体瞬时转染技术转染PTEN siRNA沉默A2780T细胞中PTEN表达。结果表明，与转染siRNA 阴性对照组相比，转染PTEN siRNA沉默PTEN表达后A2780T 细胞存活率和IC50值显著减低，P-gp，MRP1 和ABCG2 蛋白表达降低。由此提示，PTEN作为miR-152-3p 的靶基因，可能受miR-152-3p的正向调控，影响A2780T 细胞对紫杉醇的耐药性，其潜在机制还需进一步研究。

本研究的局限性在于仅用A2780T 细胞进行了相关的实验，若进一步探讨具体的分子机制，尚需用其他卵巢癌紫杉醇耐药细胞如紫杉醇耐药细胞SKOV-3/Taxol等进行深入研究。

综上所述，miR-152-3p 在A2780T 细胞中高表达，其表达下调可抑制A2780T 细胞增殖和迁移，促进细胞凋亡，降低A2780T 细胞对紫杉醇的耐药性，该作用可能是通过降低其靶基因PTEN表达发挥的。本研究或将为寻找并分析卵巢癌紫杉醇耐药的治疗靶点提供新方向，并为临床逆转卵巢癌耐药、提高卵巢癌治疗效果提供参考。