隐丹参酮通过调节TGF-β/Smad通路改善高氧诱导肺损伤的纤维化过程

马萌萌，包天平，曹林霞，李靖燕，余冰睿，田兆方

南京医科大学附属淮安第一医院新生儿科，淮安市小儿呼吸诊疗重点实验室，江苏 淮安 223300

支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是早产儿常见的一种慢性呼吸系统疾病，在出生胎龄＜29周的新生儿中发病率高达45%［1-2］。BPD的发病机制目前仍未明确，其主要的病理学特点包括肺泡破坏、纤维化、微血管发育异常以及气道损害［3］，其中肺纤维化是BPD 的主要病理特征。在高氧诱导的BPD 模型中，肺泡的发育、修复和再生受到成纤维细胞的影响，从而导致细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的重塑及纤维化的发展，导致肺部纤维化进一步加重［4］。目前，对于这种长期存在的慢性呼吸道疾病，既不能预防也不能有效治疗，因此寻找BPD的特效药十分重要。

隐丹参酮（cryptotanshinone，CTS）是从传统中药丹参中提取的一种活性成分，其生物学活性丰富，具有抗炎［5］、抗纤维化［6］、抗肿瘤［7］及神经保护［8］等作用。近期研究表明，CTS 可以通过逆转上皮间充质转化［9］、抑制Smad及STAT3通路［10］来改善博来霉素诱导的肺纤维化，但在高氧诱导的肺损伤纤维化中，尚无相关报道，本研究利用高氧诱导新生鼠BPD 模型及体外人胚肺成纤维细胞培养模型，旨在探讨CTS在高氧引致的肺纤维化中的作用及机制。

1 材料和方法

1.1 材料

CTS（纯度≥98%，批号HY-NO174，MCE 公司，美国）；α-SMA、TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3（Abcam 公 司，英 国）；p-Smad3（批号9520T，CST公司，美国）；GAPDH（批号6004-1-ig，武汉三鹰Proteintech 公司）；Ham’s F-12K 培养基（批号A211013，上海BasalMedia公司）；RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、ECL 发光液（苏州新赛美生物科技有限公司）；逆转录试剂盒、聚合酶链反应试剂盒、CCK-8 溶液（批号分别为PE5402、PC5902、PC001，南京Proteinbio公司）。

CY-12c 型测氧仪（杭州佳长电子科技有限公司）；LightCyclePCR 仪（Roche 公司，美国）；酶标仪（BioTek公司，美国）；电泳仪、凝胶成像仪（BIO-RAD公司，美国）。

人胚肺成纤维细胞（HFL-1）购于无锡欣润生物科技有限公司，培养于含10%胎牛血清的Ham’s F-12K 培养基中，置于含5%CO2的37 ℃恒温培养箱中。SD 大鼠［生产许可证编号SCXK（京）2019-0010］饲养于南京医科大学附属淮安第一医院，选取12周龄的SD大鼠按雄雌比例1∶3进行合笼，待所有孕鼠自然分娩后选取24 h 内雄性SD 大鼠用。本研究已获得南京医科大学附属淮安一院伦理委员会批准（伦理编号：DW-P-2023-001-10）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与造模

新生SD雄性大鼠随机分为5组，每组8只，分别为空气组、高氧组、CTS 低剂量组（7.5 mg/kg）、CTS中剂量组（15 mg/kg）及CTS 高剂量组（30 mg/kg）。高氧组及CTS 干预组连续吸入95%O27 d，空气组置于室内环境（21%O2）中7 d。每日8：30—9：30开箱操作，CTS溶于DMSO中进行腹腔注射，高氧组及空气组同时注射等量的DMSO。氧浓度分析仪连续监测箱内氧气浓度，并放置钠石灰吸收老鼠呼出的CO2，哺乳鼠每日在高氧和空气环境之间交换，以防止母鼠不耐受高氧出现死亡情况。7 d后对全部鼠实施安乐死，立即取左肺上叶用4%多聚甲醛固定供）苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）和马松（Masson）染色实验用，剩余肺组织置于-80 ℃冰箱中待测。

1.2.2 肺组织病理学检测

左肺上叶用4%多聚甲醛固定过夜后包埋在蜡块中，切成4 μm厚的连续切片，之后在室温条件下进行HE染色以及Masson染色。根据HE染色情况，每张切片随机选取6个视野，取平均值计算辐射肺泡状计数（radical alveolar counts，RAC），并根据Masson染色结果参考文献［11-12］进行纤维化评分。

1.2.3 RT-qPCR

提取肺组织总RNA 后，使用逆转录试剂盒逆转录为cDNA，按照聚合酶链反应试剂盒说明加入2×SYBR qPCR Mix 12.5 μL、cDNA 1 μL、前引物（10 μmol/L）0.5 μL 和后引物（10 μmol/L）0.5 μL，最后ddH2O定容至25 μL后在实时荧光定量PCR仪器上进行PCR 扩增。引物序列为：TGF-β1 F：5′-CCTGGACACACAGTACAGCA-3′；TGF-β1 R：5′-CCACGTAGTAGACGATGGGC-3′；α-SMA F：5′-CATCCGACCTTGCTAACGGA-3′；α-SMA R：5′-CCACATACATGGCAGGGACA-3′。

1.2.4 HFL-1细胞分组及处理

取对数生长期的HFL-1 细胞分为3 组，即空气组、高氧组及CTS干预组，均匀铺于6孔板，细胞饥饿12 h后干预组予CTS 10 μmol/L处理，高氧及空气组加入等量的溶剂DMSO，随后高氧组及CTS干预组置于95%O2、5%CO2、37 ℃恒温培养箱中培养24 h。

1.2.5 CCK-8测定HFL-1细胞活力

HFL-1细胞以5×104个/mL的密度均匀铺于96孔板，并在培养箱中培养过夜，将不同浓度溶于DMSO的CTS（0、2.5、5.0、10.0 μmol/L）处理细胞24 h，之后每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液继续孵育2 h，使用酶标仪在450 nm处测量每个孔的吸光度值，每孔设4个复孔取平均值，重复实验3次。

1.2.6 Western blot

提取各组新生SD 鼠肺组织及HFL-1 细胞的总蛋白，使用BCA法测定总浓度，然后在SDS-PAGE凝胶电泳中分离蛋白质样品并湿转到PVDF 膜上，之后脱脂牛奶溶液封闭1 h 后与以下一抗4 ℃孵育过夜：α-SMA（1∶1 000）、TGF-β1（1∶1 000）、Smad2（1∶500）、p-Smad2（1∶2 000）、Smad3（1∶1 000）、p-Smad3（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）。TBST 洗膜后与二抗室温孵育1 h，最后使用超强发光液在凝胶成像系统进行曝光Image J 软件定量分析。

1.3 统计学方法

所有数据采用统计软件SPSS 27.0进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析比较各组数据，LSD-t检验进行两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CTS对新生SD大鼠肺组织病理学影响

HE染色显示高氧组较空气组肺泡结构紊乱，肺泡形态变大，数目减少，RAC值下降（P＜0.05）；不同剂量的CTS干预后肺泡形态好转，RAC值也较高氧组明显上升（P＜0.05，图1）。

图1 SD新生大鼠肺组织HE染色（×100）Figure 1 HE staining of lung tissue from neonatal SD rats（×100）

Masson 染色结果显示，与空气对照组相比，高氧组胶原纤维含量明显上升，肺泡排列不规则，肺泡间隔增厚。CTS 干预后纤维化评分较高氧组降低，其中高剂量的CTS 效果最好（P＜0.05，图2）。

图2 SD新生大鼠肺组织Masson染色（×200）Figure 2 Masson staining of lung tissue from neonatal SD rat（×200）

2.2 CTS 对SD 新生大鼠肺组织中TGF-β1 及α-SMA mRNA水平影响

模型组SD 新生大鼠肺中TGF-β1（图3A）及α-SMA（图3B）的mRNA表达水平较空气组明显升高，不同剂量的CTS 干预后逐渐好转，较高氧组明显下降（P＜0.05）。

图3 各组新生SD 大鼠肺组织中TGF-β1 及α-SMA 的mRNA 表达水平Figure 3 mRNA expression levels of TGF-β1 and α-SMA in neonatal SD rats lung tissue in each group

2.3 CTS 对SD 新生大鼠肺组织中Smad2/3 通路蛋白表达的影响

Western blot 检测结果显示高氧暴露后，模型组的p-Smad2/Smad2 蛋白水平较空气对照组明显升高（P＜0.05，图4A、B），p-Smad3/Smad3 在高氧组明显上升（P＜0.05，图4A、C），p-Smad2/Smad2及p-Smad3/Smad3比值在CTS处理后呈剂量依赖方式降低（P＜0.05）。

图4 新生SD大鼠肺组织Smad2/3通路蛋白表达情况Figure 4 Smad2/3 pathway protein expression in lung tissue of neonatal SD rats

2.4 CTS对体外HFL-1增殖活力的影响

体外研究中，首先用不同浓度CTS（2.5、5.0、10.0 mmol/L）处理HFL-1细胞后，细胞的增殖活力均在95%以上，其中CTS 10.0 μmol/L 以内各组与对照组无统计学差异（P＞0.05，图5A），提示10 μmol/L浓度以内的CTS不影响细胞增殖，故选用10 μmol/L的CTS 用于后续实验。在高氧条件下，细胞增殖活力受到影响，高氧组较空气组下降，但CTS处理后可以提高细胞活力（P＜0.05，图5B）。

图5 CTS通过激活TGF-β/Smad信号通路降低高氧下HFL-1细胞的α-SMA水平，提高HFL-1细胞活力Figure 5 CTS reduced α-SMA levels by activating TGF-β/Smad signalling pathway and improved viability of HFL-1 cells

2.5 CTS 对HFL-1 细胞α-SMA 及TGF-β/Smad 通路蛋白表达的影响

体外实验中，高氧诱导HFL-1细胞后，细胞内的α-SMA 表达明显上升，在CTS 处理后表达下降（P＜0.05，图5C、D）。在TGF-β1/Smad 通路蛋白表达中，高氧组与空气组相比，TGF-β1及Smad2/3磷酸化蛋白含量上升，CTS组较高氧组明显下降（P＜0.05，图5C，E～G）。

3 讨论

BPD 不仅是一种局部的肺部疾病，也是一种全身性疾病，对患儿成年以后的健康和生活质量具有一定影响［13-15］，随着目前医疗水平的提高，BPD的生存率虽然提高了，但不幸的是其发生率仍然居高不下［16］，且目前仍然没有特效治疗药物，因此BPD 在新生儿呼吸系统疾病中一直备受关注。CTS是一种从传统中药丹参中提取的一种天然化合物，其生物学活性丰富，在多种疾病中具有潜在的治疗价值［17］，本研究主要探索CTS 在BPD 相关纤维化中是否发挥作用。

纤维化作为BPD 的主要病理特征在BPD 的发展中占据重要地位，在肺部发育中，成纤维细胞可维持肺泡和支气管的完整性，但在高氧诱导之后会发生显著的形态学变化［18-19］，可进一步分化为肌成纤维细胞，使得肺泡上皮-间充质信号转导被破坏，不能正常维持上皮细胞的生长和分化，导致肺部出现异常修复并最终出现纤维化［20-21］。目前，高氧在BPD 发展中的作用已在实验模型和临床试验中得到证实，高氧诱导的BPD实验动物模型已经被广泛运用［22］，本研究通过高氧BPD模型发现，CTS改善了BPD 模型新生大鼠的肺部病理情况，特别是纤维化现象，体内外结果均显示纤维化标志物α-SMA的水平降低，提示CTS 可改善高氧诱导的肺纤维化从而起到肺部保护作用。

生长因子TGF-β被认为是肺发育异常的主要调节因子，通过TGF-β/Smad2/3 的典型信号转导调节早期肺发育［23-24］，该通路与异常肺泡化关系密切，TGF-β1还可诱导成纤维细胞迁移、肌成纤维细胞的增殖和分化以及ECM的沉积［25］，目前TGF-β靶基因越来越被认为是BPD 的致病因素［26］。TGF-β1 启动了成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，并导致标志性蛋白α-SMA的显著增加［27］，这表明抑制纤维化细胞因子TGF-β1 和靶向TGF-β信号通路是BPD 中纤维化治疗的潜在策略。本研究结果显示CTS可以降低高氧后肺组织及HFL-1中的TGF-β1水平，同时降低下游Smad2/3 的磷酸化表达含量，表明CTS 可能通过TGF-β1/Smad 通路在BPD 模型中发挥抗纤维化的作用。

综上所述，CTS 对高氧诱导肺损伤的BPD 模型具有保护作用，降低纤维化标志物α-SMA 的水平，其机制可能与TGF-β1/Smad 通路有关，具体上下游的机制有待进一步研究。