毫针和火针疗法治疗骨髓抑制大鼠模型的分子作用机制

杨晓琳 李岩

1天津医科大学第二医院中医科，天津 300211；2天津市公安医院针灸理疗科，天津300040

骨髓抑制是指临床中由于各种原因导致的骨髓中血细胞前体活性下降。骨髓中含有丰富的造血干细胞，可以分化为白细胞、红细胞和血小板。当机体受到部分抗生素、抗肿瘤药物、放疗的作用时，会出现骨髓抑制的副作用，导致造血干细胞不能正常分化，外周血中的成熟红细胞、白细胞和血小板减少，患者出现贫血、出血、感染等症状。常见的导致骨髓抑制的药物包括卡铂、顺铂和环磷酰胺等癌症化疗药物［1］。对于接受化疗的癌症患者的调查显示：癌症患者在化疗期间骨髓抑制的发生率极高。60%～70%的癌症患者因骨髓抑制的出现，必须减少或者停止癌症的临床治疗。因此，骨髓抑制使癌症患者的治疗计划受阻，患者的病情和生存质量进一步恶化。临床上使用的大多数化疗药物可对人体造血系统造成不良的反应，其中一部分化疗药物可以直接损伤外周血细胞，造成外周血象下降，而另一部分化疗药物可以作用于骨髓，造成骨髓损伤，导致血细胞生成障碍，引起外周血细胞减少［2］。因此，骨髓抑制会导致癌症患者治疗过程中产生诸如感染、败血症和脓毒症等［3］，导致患者化疗药物使用量下降，进而导致治疗效果不理想。尽管近年来针对骨髓抑制的研究取得了一定的进展，但是如何从根本上解决化疗药物诱发的骨髓抑制现象，仍然是癌症治疗中的难题，始终困扰着癌症患者和医护人员［4］。因此，需要新的治疗手段以从根本上解决临床中骨髓抑制的症状。

毫针和火针疗法属于中医微创治疗手段。火针和毫针各有所长，火针挟火气盛，毫针纤细痛微，毫针和火针疗法优化了针灸疗法，提高了针灸疗效。毫针和火针疗法已被大多数患者所接受［5］。中医理论认为，火针和毫针可放血，“宛陈则除之者，去血脉也”；可速刺，以纤细之体携火直入；可留刺，疾入穴下，留驻穴中；可决血调气，通经活络，兼有贺氏“强通”“温通”“微通”三通之功能［6］。现代医学认为，毫针和火针疗法治疗疾病的作用原理是对穴位的剌激有物理的机械刺激和温热剌激及生理的无菌性灼伤剌激。三者合一，增强了刺激强度、作用时间。毫针和火针疗法，借“火”之力通经活络，集针之法激发经气，取灸之温阳驱散湿寒。如针刺穴下，不用提插捻转，其经气自来，即刻退出针来，针还像留在穴中，其经气缠绵，针感不绝，疗效可立竿见影［7-9］。

本研究开展于2022 年3 月至9 月，通过环磷酰胺诱导建立大鼠骨髓抑制模型，并且通过检测毫针和火针治疗前后大鼠血细胞数量、病理情况，骨髓基质细胞的细胞周期以及细胞周期相关蛋白表达等多项指标，探究毫针和火针治疗大鼠骨髓抑制的分子机制，为毫针和火针治疗骨髓抑制的临床应用提供理论基础和临床支持。

资料与方法

1.实验动物

SD 大鼠共96只，4～6周龄，体质量为250～300 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物合格证号SCXK（京）2021-0012。饲养于中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心（SPF 级）；饲养条件：常规饲养7 d 以适应环境，饲养期间给予大鼠标准颗粒饲料及纯净饮水，光和暗循环各12 h，相对湿度45%～65%，温度18～23 ℃。

2.主要试剂及仪器

环磷酰胺（货号BP1094）（美国Merck 公司）；4%多聚甲醛（货号P885233）（上海麦克林生化科技股份有限公司）；快速瑞氏吉姆沙染色试剂（货号AC11921-3*30 ml）（上海吉至生化科技有限公司）；EDTA 脱钙液（货号AR1071）（博士德生化科技有限公司）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（货号P0012S）、RIPA蛋白裂解液（货号P0013B）（上海碧云天生物技术有限公司）；细胞周期检测试剂盒（货号C1052）（上海碧云天生物技术有限公司）；CD6 抗体（货号bs-2488R）、CD4 抗 体（货 号bs-0647R）、Cyclin D1 抗 体（货 号bs-0623R）、E2F1 抗体（货号bs-23184R）、GAPDH 抗体（货号bs-2188R）（北京博奥森生物技术有限公司）；澳洲胎牛血清（货号C0227）（上海碧云天生物技术有限公司）。

DYCZ-24DN SDS-PAGE 蛋白电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；5200 系列全自动化学发光/荧光图像分析系统（上海天能生命科学有限公司）；电子显微镜（DM4000B，Leika 公司）；低温冷冻离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；DK-320型全自动多功能酶标仪（上海德卡实验室系统科技有限公司）；流式细胞仪（NovoCyte，艾森生物有限公司）；血细胞自动分析仪（KT6610VET，南京华仁生物科技有限公司）。

3.动物分组及模型制备

适应性饲养7 d后，96只大鼠全部入组。全部称取并记录大鼠体质量，根据体质量情况，依次进行编号，采用随机数字表法将大鼠分为对照组、模型组、火针组、毫针组，各24只；每组再随机分为4组，每组6只。除对照组外，其余各组大鼠利用环磷酰胺建立大鼠骨髓抑制模型。腹腔注射环磷酰胺50 mg/（kg·d），单次给药，连续3 d，利用药代动力学分析，4 d 后环磷酰胺活性消失，因此给药环磷酰胺4 d 后，环磷酰胺化疗大鼠模型即造模成功。同时，对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水。其余各组大鼠依次在造模成功后4 h进行治疗。

对照组和模型组大鼠处理方式：每天陪同抓取、固定，但是不进行治疗。火针组大鼠处理方式：根据编号依次将大鼠俯卧固定于鼠板上，针具选用华佗牌毫火针（半寸，0.18 mm×13.00 mm），选取双侧足三里穴（足三里穴位于大鼠后肢膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm 处），于造模后第1 天、第3 天、第5 天、第7 天，采用火针点刺法垂直刺入3 mm，不留针，隔日1次，连续7 d。毫针组大鼠处理方式：根据编号依次将大鼠俯卧固定于鼠板上，针具、选穴同火针组，垂直刺入3 mm，留针6 min，于造模后第1 天开始，每天1次，连续7 d。

4.生化指标检测

4.1.外周血细胞计数 每组大鼠均选取第4 组进行外周血细胞计数，作为血常规组测量血常规指标（白细胞、红细胞、血红蛋白和血小板），分别于造模前、造模完成当日（d0），治疗后第1（d1）、3（d3）、5（d5）、7（d7）天，晨起空腹状态下，采集尾静脉血10 μl，迅速进行血液稀释，摇匀后上机测定血常规。

4.2.骨髓切片瑞氏吉姆沙染色 每组大鼠均选取第4 组，治疗后第7 天采集尾静脉血后颈椎脱臼法处死，取出大鼠的股骨组织置于4%多聚甲醛溶液固定24 h，经10%EDTA 脱钙液慢性脱钙4～5 周。将脱钙好的标本经不同浓度的乙醇梯度脱水，二甲苯透化标本，然后进行浸蜡和包埋组织。将包埋好的蜡块切片（切片厚度约3 μm）再经二甲苯脱蜡，蒸馏水洗涤，滴加1 ml 瑞氏吉姆沙A 液于切片上，并让染液迅速覆盖整个标本染色1～2 min，再缓慢滴加瑞氏吉姆沙B 液于A 液上面，用移液器轻轻吹打，使两液充分混合，染色5～10 min，蒸馏水冲洗后烘烤干燥，封片后在电子显微镜下观察病理变化。

4.3.骨髓有核细胞悬液的制备及骨髓单核成纤维细胞培养 每组大鼠均选择4 个时间点进行骨髓有核细胞悬液的制备，分别选取第1 组，分别于造模后第1 天；选取第2 组，分别于治疗后第3 天；选取第3 组，分别于治疗后第5 天；选取第4 组，分别于治疗后第7 天，颈椎脱臼法处死大鼠，经75%乙醇消毒后，置于超净工作台中取大鼠的双侧股骨组织，用手术剪剖开股骨两端，两侧股骨用1 ml DMEM 培养基反复冲洗骨髓腔收集原代骨髓细胞，最后，经过筛网过滤制成骨髓单核细胞悬液。将骨髓单核细胞悬液按1×106个/ml 的细胞密度接种于含有10%胎牛血清的完全培养基中，在37 ℃、5% CO2和饱和湿度条件下，细胞换液培养，在培养7 d后观察骨髓单核成纤维细胞的生长状况。

4.4.流式细胞法检测骨髓成纤维细胞的细胞周期 收集各组骨髓成纤维细胞，PBS 缓冲液漂洗1 次，将细胞重悬于0.3 ml 的预冷PBS 缓冲液中，加入0.7 ml 预冷乙醇，轻柔混匀2 次，4 ℃固定过夜。1 000 r/min 离心5 min，有效离心半径是10 cm，去上清，加入PI 染色缓冲液（50 mg/L PI，0.1 g/L RNase A 和0.05% Triton X-100）总体积1.0 ml/样品，37 ℃孵育40 min。然后，1 000 r/min离心5 min，有效离心半径是10 cm，小心去除上清，加入1.0 ml PBS 缓冲液，轻柔混匀，300目筛网过滤后，利用流式细胞仪进行检测。

4.5.免疫印记法检测细胞周期相关蛋白的表达 取状态正常的各组骨髓单核成纤维细胞在RIPA 蛋白裂解液中充分裂解。用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定各组骨髓单核成纤维细胞蛋白浓度。采用SDS-PAGE 电泳法进行蛋白分离，将蛋白采用湿转法转移到PVDF 膜上。用5%封闭液封闭后，使用抗CD4（稀释比例1∶1 000）、抗CD6（稀释比例1∶8 000）、抗Cyclin D1（稀释比例1∶1 000）、抗E2F1（稀释比例1∶8 000）和抗GAPDH（稀释比例1∶2 000）一抗孵育，4 ℃过夜，然后使用辣根过氧化物酶（HRP）结合的二抗室温孵育1～2 h。通过全自动化学发光图像分析系统观察和记录蛋白印迹信号，并使用Gelpro32 软件分析蛋白质的相对表达量。

5.统计学方法

采用SPSS 20.0 软件进行实验数据的统计和分析，图表采用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计和制作。实验数据满足正态分布且方差整齐时，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。实验数据不满足正态分布或方差不齐时，则选择Bonferroni 校正和Kruskal-Wallis 检验。P＜0.05被认为差异有统计学意义。

结果

1.各组大鼠外周血细胞数量和血红蛋白含量比较

由表1 结果可见，模型组白细胞数量和血小板数量低于对照组，红细胞数量和血红蛋白含量高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。治疗后1、3、5、7 d，火针组和毫针组白细胞数量和血小板数量高于模型组，红细胞数量和血红蛋白含量低于模型组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。这表明毫针和火针治疗均可以改善环磷酰胺所致的大鼠骨髓抑制状态。

表1 各组SD大鼠外周血细胞数量和血红蛋白含量（）

表1 各组SD大鼠外周血细胞数量和血红蛋白含量（）

注：对照组和模型组大鼠每天陪同抓取、固定，但是不进行治疗；火针组大鼠根据编号依次将大鼠俯卧固定于鼠板上，选取双侧足三里穴于造模后第1天、第3天、第5天、第7天，采用火针点刺法治疗，火针垂直刺入3 mm，不留针，隔日1次，连续7 d；毫针组大鼠根据编号依次将大鼠俯卧固定于鼠板上，针具、选穴同火针组，垂直刺入3 mm，留针6 min，于造模后第1 天开始，每天1 次，连续7 d。与对照组比较，aP＜0.05；火针组与模型组比较，bP＜0.05；毫针组与模型组比较，cP＜0.05；毫针组与火针组比较，dP＜0.05

2.各组大鼠骨髓组织病理学结果比较

由图1 结果可见，对照组（A）骨髓组织切片中可见明显的骨髓原始细胞（如图黑色箭头所示）及杆状核细胞（如图黄色箭头所示）；模型组（B）骨髓组织切片中仅可见骨髓原始细胞（如图黑色箭头所示），且细胞数量明显减少，并未发现杆状核细胞；毫针组（C）和火针组（D）骨髓组织切片中，与模型组相比，骨髓原始细胞数量明显增加，并且可见杆状核细胞。这表明毫针和火针治疗对于骨髓抑制的大鼠有明显的修复作用。

图1 各组SD大鼠骨髓细胞瑞氏吉姆沙染色结果比较（×100）。A：对照组；B：模型组；C：毫针组；D：火针组

3.各组大鼠骨髓单核成纤维细胞周期结果比较

由表2 可见，大鼠骨髓抑制建模后，骨髓单核成纤维细胞周期停留在G0/G1 期，分裂的骨髓单核细胞无法进入S期，进而进入休眠状态。火针组和毫针组G0/G1 期细胞百分率的变化趋势基本相同，但火针组和毫针组G0/G1 期骨髓单核成纤维细胞百分率始终低于模型组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），其中火针组变化较毫针组更显著（均P＜0.05），且S期和G2/M期骨髓单核成纤维细胞百分率始终高于模型组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结果表明毫针和火针可不同程度释放G1 和S 期骨髓单核成纤维细胞，使细胞进入快速增殖阶段，促进骨髓单核成纤维细胞向各种血细胞分化，进而增加白细胞和血小板的比例，减少红细胞的比例，弥补各种有核血细胞的缺少，从而有效改善大鼠骨髓抑制状态。

表2 各组SD大鼠中骨髓单核成纤维细胞周期检测比较（%（）

表2 各组SD大鼠中骨髓单核成纤维细胞周期检测比较（%（）

注：对照组和模型组大鼠每天陪同抓取、固定，但是不进行治疗；火针组大鼠根据编号依次将大鼠俯卧固定于鼠板上，选取双侧足三里穴于造模后第1天、第3天、第5天、第7天，采用火针点刺法治疗，火针垂直刺入3 mm，不留针，隔日1 次，连续7 d；毫针组大鼠根据编号依次将大鼠俯卧固定于鼠板上，针具、选穴同火针组，垂直刺入3 mm，留针6 min，于造模后第1天开始，每天1次，连续7 d。“-”表示无数据。与对照组比较，aP＜0.05；火针组与模型组比较，bP＜0.05；毫针组与模型组比较，cP＜0.05；毫针组与火针组比较，dP＜0.05

4.各组大鼠单核成纤维细胞中细胞周期相关蛋白表达结果比较

选取每组大鼠骨髓单核成纤维细胞进行蛋白表达量检测。图2 和表3 结果所示，与对照组比较，模型组大鼠骨髓单核成纤维细胞中细胞周期相关蛋白CD4、CD6、Cylcin D1 和E2F1 相对表达量明显下调（均P＜0.05）；与模型组比较，毫针组和火针组治疗后3、7 d大鼠骨髓单核成纤维细胞中CD4、CD6、Cylcin D1 和E2F1 蛋白相对表达量明显上调（均P＜0.05）；火针组细胞周期相关蛋白CD4、CD6、Cylcin D1和E2F1表达上调更显著（均P＜0.05）。

图2 各组SD大鼠中单核成纤维细胞中细胞周期相关蛋白表达结果

表3 各组SD大鼠中骨髓单核成纤维细胞蛋白相对表达量比较（）

表3 各组SD大鼠中骨髓单核成纤维细胞蛋白相对表达量比较（）

注：对照组和模型组大鼠每天陪同抓取、固定，但是不进行治疗；火针组大鼠根据编号依次将大鼠俯卧固定于鼠板上，选取双侧足三里穴于造模后第1天、第3天、第5天、第7天，采用火针点刺法治疗，火针垂直刺入3 mm，不留针，隔日1次，连续7 d；毫针组大鼠根据编号依次将大鼠俯卧固定于鼠板上，针具、选穴同火针组，垂直刺入3 mm，留针6 min，于造模后第1 天开始，每天1 次，连续7 d。与对照组比较，aP＜0.05；火针组与模型组比较，bP＜0.05；毫针组与模型组比较，cP＜0.05；毫针组与火针组比较，dP＜0.05

讨论

本研究表明，毫针和火针治疗均可以有效改善大鼠骨髓抑制的症状。骨髓抑制大鼠模型的建立可以在动物体内有效模拟化疗药物使用后，癌症患者产生骨髓抑制的不良症状。在本项研究中，笔者成功创建了骨髓抑制大鼠模型，为骨髓抑制的深入研究和科学探索提供了的研究基础和实践手段［10］。在本次实验中，使用腹腔注射环磷酰胺的方法建立骨髓抑制大鼠模型。环磷酰胺是临床常用的化疗药物，主要有抗肿瘤作用。环磷酰胺能够与肿瘤细胞的DNA结合，打断肿瘤细胞的DNA 分子的合成，进而阻断肿瘤细胞的生长和繁殖［11］。环磷酰胺的不良反应与其剂量相关，比较常见的不良反应有脱发、恶心呕吐等。这些不良反应都较轻，其严重的不良反应是骨髓抑制。环磷酰胺导致骨髓抑制的分子机制是打破骨髓中处于休眠和增殖状态的造血干细胞的代谢平衡，最终导致机体出现骨髓抑制［12-14］。骨髓抑制影响生成红细胞、血小板和白细胞的数量，一般在临床通过检测这些不同血细胞的数量来进行衡量和评估。

毫针和火针是一门创新的中医微创治疗技术，是针灸学的重要组成部分，是针灸疗法中独特的治疗体系。本研究表明，毫针和火针可改善大鼠骨髓抑制，其作用机制可能是通过上调骨髓细胞周期蛋白的表达，使造血干细胞的增殖和休眠重新恢复平衡，进而增加红细胞、血小板和白细胞的数量［15-16］。另外，足三里穴是足阳明胃经的主要穴位之一，属“土穴”，能够燥化脾湿，生发胃气。如《灵枢》中所述：“邪在脾胃，则病肌肉痛；阳气有余，阴气不足，则热中善饥；阳气不足，阴气有余，则寒中肠鸣腹痛；阴阳俱有余，若俱不足，则有寒有热；皆调于足三里［17］。”《灵枢》中还讲到：“著痹不去，久寒不已，卒取其三里骨为干；肠中不便，取三里……善呕，呕有苦，长太息，恐人将捕之，邪在胆，逆在胃，胆液泄则口苦，胃气逆则呕苦，故曰呕胆，取三里以下胃气逆［18］。”《外台》里讲到：“凡人年三十以上，苦不灸三里，令人气上眼？以三里下气［19］。”可见足三里是治疗“本虚”的要穴，可以调理肝脾，补益气血，改善肿瘤患者的“本虚”［20］。因此，对于毫针和火针治疗效果来讲，足三里穴位的选择也是极为关键的。

综上所述，毫针和火针治疗大鼠骨髓抑制的可能作用机制可能是通过调节骨髓单核细胞中CD4、CD6、Cylcin D1 和E2F1 蛋白的表达，从而恢复骨髓基质细胞增殖和休眠的代谢平衡。但是，本研究中并未直接验证毫针和火针对细胞周期信号通路的调控作用。因此，在今后的研究中，可通过基因敲除和信号通路抑制等方法进一步阐释毫针和火针治疗骨髓抑制的分子机制，为毫针和火针治疗骨髓抑制的临床应用提供更为有利的理论基础和科学依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明 杨晓琳：酝酿和设计实验，实施研究，采集数据，分析/解释数据，起草文章，统计分析；李岩：对文章的知识性内容作批评性审阅，行政、技术或材料支持，指导