喉鳞状细胞癌中HPV与TAP、CD8、HLA表达的相关性及临床意义

李逸群 易丽君 陈庆勇 李云荣 李红 安姝憬

1滨州医学院附属医院病理科，滨州 256603；2滨州医学院附属医院医务处、耳鼻咽喉科，滨州 256603；3滨州医学院第一临床医学院，滨州 256603

头颈部鳞癌是全球第六大常见癌症，每年导致超过20 万人死亡［1］。其中喉鳞状细胞癌占头颈部鳞癌的25%～30%，是头颈部最常见的恶性肿瘤。过去认为吸烟和饮酒是喉鳞状细胞癌发生的危险因素，但随着非吸烟和饮酒的喉鳞状细胞癌患者增加，人们越来越重视其他危险因素的研究，其中包括人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）的感染［2］。抗原加工相关转运体（transporter associated with antigen processing，TAP）在主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ类抗原途径中起着至关重要的作用，在肿瘤和病毒感染中，TAP 可将肿瘤性或病毒性抗原提呈给人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）分子，被CD8+T 淋巴细胞识别后启动细胞免疫，因此，有研究者认为TAP 可以作为肿瘤免疫治疗的靶点［3-4］。本研究通过免疫组化方法检测P16、TAP1、TAP2、HLA、CD8在喉鳞状细胞癌中的表达水平，探讨P16、TAP1、TAP2、HLA、CD8 与喉鳞状细胞癌临床病理特征的关系，以及TAP1、TAP2、HLA、CD8与HPV感染的相关性。

资料与方法

1.一般资料

1.1.临床资料 收集滨州医学院附属医院2013 年1 月至2018 年12 月行手术切除的84 例喉鳞状细胞癌患者的组织蜡块进行临床研究。所有患者术前均未经过放、化疗及生物学治疗。其中，男性68 例，女性16 例，年龄45～78 岁，中位年龄63 岁；肿瘤长径0.6～6.0 cm，中位长径2.6 cm；组织学类型：角化型43 例，非角化型41 例；有淋巴结转移者36 例，无淋巴结转移者48 例；参照美国癌症联合会（AJCC）第八版癌症分期手册，Ⅰ～Ⅱ期33 例，Ⅲ～Ⅳ期51 例。具有完整随访资料的患者73 例，随访时间截至2023 年2 月或患者死亡。

本研究通过滨州医学院附属医院医学伦理委员会审核（KYLL-2022-33）。

1.2.试剂 兔抗人TAP1 多克隆抗体购自abcepta 公司，兔抗人TAP2 多克隆抗体购自Affinity 公司，兔抗人P16、CD8、多克隆抗体和免疫组化试剂盒均购自北京中杉金桥公司，免抗人HLA多克隆抗体购自Proteintech公司。

2.方法

采用免疫组化EnVision 法染色，常规石蜡组织切片经二甲苯脱蜡至水，乙二胺四乙酸修复抗原，3% H2O2孵育，滴加一抗TAP1（1∶100）、TAP2（1∶150）、HLA（1∶100）、CD8（即用型）、P16（即用型），置于4 ℃过夜孵育。磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2 次后滴加二抗，37 ℃孵育30 min，洗涤后二氨基联苯氨（DAB）显色，苏木素复染，分化，脱水透明，中性树胶封固。

3.结果判定

P16 主要表达于肿瘤细胞核或细胞质，呈棕黄色颗粒，以＞70%的细胞出现核或质的强阳性表达为阳性判读标准［5］。CD8细胞阳性着色定位于淋巴细胞胞膜，呈棕褐色粗颗粒，先在低倍镜下观察整张切片，分别在癌巢及癌旁组织中选取CD8 细胞丰富的5 个高倍视野（×400）计算其阳性细胞数，以癌巢和癌旁组织内CD8 阳性细胞的均数106 作为临界值，106 以下为CD8 细胞阴性表达，106 以上为CD8 细胞阳性表达［6-7］。HLA 主要表达于肿瘤细胞胞质及胞膜，TAP1、TAP2主要表达于肿瘤细胞质及胞核，呈棕黄色，免疫组化结果综合染色反应强度和阳性细胞数量两个方面进行半定量记分法判定：按阳性着色程度评分，0 分为无色，1 分为浅黄色，2 分为棕黄色，3 分为棕褐色。按阳性细胞比例评分，0分：＜5%，1分：5%～10%，2分：＞10%～50%，3分：＞50%～80%，4分：＞80%。将两项评分结果相乘：≥4 分为阳性，＜4 分为阴性［8-9］。

4.统计学方法

采用SPSS 25.0 软件进行统计学分析，计数资料用率表示，资料分组间比较采用χ2检验或Fisher 精确检验，相关性分析采用Spearson 关联性分析，生存曲线采用Kaplan-Meier 法绘制，采用Cox比例风险回归模型进行多因素生存分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.喉鳞状细胞癌及癌旁正常组织P16、TAP1、TAP2、HLA、CD8的表达

免疫组化结果显示，P16主要表达于肿瘤细胞核或细胞质，在喉鳞状细胞癌组织中的阳性率为11.9%，在癌旁正常组织中阴性表达（图1A、图1B）；CD8 主要表达于淋巴细胞胞膜，在喉鳞状细胞癌组织中的阳性率为38.1%，低于癌旁正常组织（56%），见图1C、图1D；HLA 主要表达于肿瘤细胞胞质及胞膜，在喉鳞状细胞癌组织中的阳性率为42.8%，低于癌旁正常组织（57.1%），见图1E、图1F；TAP1、TAP2 主要表达于肿瘤细胞胞质及胞核，在喉鳞状细胞癌组织中的阳性率分别为41.7%、29.8%，均低于癌旁正常组织（69%、56%），见图1G、图1H、图1I、图1J。其中，TAP2 在癌和癌旁正常组织中的表达，差异有统计学意义（χ2=5.08，P＜0.05）。见表1。

表1 P16、TAP1、TAP2、HLA、CD8在喉鳞状细胞癌及癌旁正常组织中的表达[例（%）]

2.喉鳞状细胞癌中TAP1、TAP2、HLA、CD8 和P16 表达与临床病理特征的关系

喉鳞状细胞癌组织中浸润淋巴细胞CD8的表达与临床分期有关，Ⅲ期-Ⅳ期肿瘤中淋巴细胞CD8阳性表达率高于Ⅰ期～Ⅱ期，差异有统计学意义（P＜0.05），而TAP1、TAP2、HLA、P16的表达与临床病理因素无关。见表2。

表2 84例喉鳞状细胞癌患者P16、TAP1、TAP2、HLA、CD8的表达与临床病理特征的关系（例）

3.喉鳞状细胞癌中P16 与TAP1、TAP2、HLA、CD8 表达的相关性

根据P16 免疫组化染色结果，将84 例喉鳞状细胞癌分为P16 阳性组和阴性组，并分析其与TAP1、TAP2、HLA、CD8 表达的相关性。Spearman 相关性分析显示，CD8 与P16表达呈负相关，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 喉鳞状细胞癌P16与TAP1、TAP2、HLA、CD8表达的相关性

4.喉鳞状细胞癌中TAP1、TAP2、HLA、CD8 表达的相关性

Spearman 相关性分析显示，喉鳞状细胞癌组织中TAP1 表达与TAP2、CD8 均呈正相关（r=0.295，r=0.232），HLA 的表达与CD8 的表达呈正相关（r=0.232），差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表4、表5、表6。

表4 喉鳞状细胞癌患者TAP1与TAP2、HLA、CD8表达的相关性

表5 喉鳞状细胞癌患者TAP2与HLA、CD8表达的相关性

表6 喉鳞状细胞癌患者HLA与CD8表达的相关性

5.TAP1+/TAP2+与TAP1-/TAP2-组P16、HLA、CD8 表达的相关性

根据免疫组化染色结果，将喉鳞状细胞癌分为TAP1+/TAP2+与TAP1-/TAP2-组，分析其与P16、HLA、CD8表达的相关性。TAP1+/TAP2+组中CD8 的阳性率高于TAP1-/TAP2-组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表7。

表7 喉鳞状细胞癌患者TAP1+/TAP2+、TAP1-/TAP2-与P16、HLA、CD8表达的相关性

6.预后

随访结果显示，喉鳞状细胞癌患者中位生存期为60 个月，平均5 年生存率为68.5%。Kaplan-Meier 生存分析显示，喉鳞状细胞癌患者的预后与肿瘤长径、脉管侵犯、淋巴结转移有关（P＜0.05），见图2。Cox 多因素回归模型分析显示，脉管侵犯、淋巴结转移均是喉鳞状细胞癌预后的独立危险因素（P＜0.05），见表8。

表8 84例喉鳞状细胞癌患者预后Cox多因素分析

图2 84例喉鳞状细胞癌患者预后生存曲线。A：肿瘤长径的生存分析；B：脉管侵犯的生存分析；C：淋巴结转移的生存分析

讨论

喉鳞状细胞癌是上呼吸道常见的癌症，占所有恶性肿瘤的4.5%，其发生与长期接触酒精或烟草等化学物质有关［10-11］。近年来，越来越多的研究表明喉鳞状细胞癌的发生与HPV 感染密切相关［12］。HPV 是一类双链环状DNA 病毒，具有感染皮肤和黏膜的能力。当机体免疫力低下或免疫功能受损时，HPV 可通过受损的上皮细胞感染进入宿主细胞，其病毒核酸整合进入宿主细胞基因组，引起相应的基因表达异常，促使细胞恶性转化［13］。HPV 有约179 种基因亚型，根据其致病能力不同，可分为低危型和高危型。研究表明，高危型HPV 与肿瘤发生关系最密切，包括HPV16、18、31、33、35、45、51、52 和56 等，能引起宫颈癌、头颈癌、肛门癌、阴道癌、外阴癌和阴茎癌等。喉鳞状细胞癌中最常见的亚型是HPV16，约占HPV阳性喉鳞状细胞癌的84%［14］。

HPV 约含8 000 个碱基对，分为早期区、晚期区和非编码区，其中早期区含有6个基因（E1-E7），编码与病毒复制、转录调控、翻译和细胞转化等有关的蛋白［15］。机体感染HPV后，HPV病毒的基因组整合到宿主细胞的基因组中，导致E6和E7蛋白的过度表达，从而导致P53的降解和视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，Rb）功能的失活［16］。同时，E7 干扰Rb1 的功能导致P16INK4A反馈性上调，引起P16 蛋白的过度表达，因此，检测P16 蛋白的表达情况可评估高危型HPV感染状态，目前已广泛应用于临床［17］。

Valls-Ontañón 等［18］研究表明，在口腔及口咽鳞状细胞癌中，P16 的阳性率为16.8%，在吸烟和饮酒少的年轻男性人群中多发，且P16 阳性患者的6 年生存率较高。Tumban［19］研究表明，在口咽鳞癌中HPV 的阳性率高达为33.6%，而在喉鳞状细胞癌中HPV 感染率相对较低，为20.2%。本研究采用免疫组化方法检测P16 在喉鳞状细胞癌中的表达水平，其在喉鳞状细胞癌组织中的阳性表达率为11.9%，表明喉鳞状细胞癌中存在高危型HPV 感染，与相关文献报道的口咽鳞癌的HPV 感染率相比，喉鳞状细胞癌中HPV 感染率相对较低［20］。究其原因，可能是口咽部扁桃体的隐窝和不规则表面以及舌根部的淋巴组织为HPV感染的持续存在创造了有利的环境。

TAP 由TAP1 基因、TAP2 基因编码的2 个亚单位组成，其在HLA 分子抗原提呈过程中起着重要作用，可将内源性抗原从细胞质转运到内质网腔［21-22］。在内质网中，它与其他成分一起形成多肽负载复合体，负载到新生的HLA 分子上，然后转运到细胞表面，从而被CD8+T 细胞识别，从而引发免疫反应［23］。由于TAP蛋白在将多肽转运到内质网中起关键作用，因此，TAP 的表达会影响抗原递呈的功能［24］。Yang 等［25］研究表明，胶质瘤干细胞通过下调TAP 或使TAP蛋白表达缺陷，从而降低T 细胞的认知能力，逃避免疫系统的监视，且TAP 表达下调与胶质瘤干细胞中Wnt 途径的激活有关。Ling 等［26］研究表明，TAP 的下调是结直肠肿瘤免疫逃逸的机制，也是Ⅰ～Ⅱ期结直肠肿瘤患者预后不良的因素。TAP 表达异常会影响肿瘤细胞HLA 的表达。CD8分子是T 淋巴细胞表面的糖蛋白，结合HLA 提呈的肿瘤抗原后，T 淋巴细胞活化并分化为细胞毒性T 细胞，从而发挥杀伤肿瘤细胞的作用［27］。本研究通过免疫组化方法检测TAP1、TAP2、HLA、CD8 在喉鳞状细胞癌中的表达，发现TAP1、TAP2、HLA、CD8 在喉鳞状细胞癌中均呈低表达，TAP1 的表达与TAP2、CD8 的表达呈正相关，且CD8 的表达与HLA 呈正相关。由此可见，TAP 蛋白的表达下调会抑制机体的免疫应答，进而使肿瘤细胞逃避机体的免疫监视。此外，TAP1+/TAP2+组中CD8 的阳性率高于TAP1-/TAP2-，表明当TAP1、TAP2 均表达阳性时，能激活更多的CD8+T 细胞参与免疫应答的调节。

病毒感染亦可影响TAP 的表达状态。Steinbach 和Riemer［28］研究发现宫颈癌中TAP1 的表达被抑制，在HPV16阳性的宫颈癌中，HPV16 E7可抑制TAP1的转录，并使其启动子高度甲基化。在口腔鳞状细胞癌中研究发现HPV介导的免疫逃避主要是通过淋巴毒素途径的信号转导网络介导的，特别是淋巴毒素（LT）α1β2 和LTβR，HPV16 E6 促进LTα1β2 和LTβR 的表达，从而激活LT 信号通路，并抑制TAP 的功能［29］。由于受样本量少的影响，虽然本研究统计学分析P16 的表达与TAP1、TAP2 无相关性，但是在P16 阳性组中，TAP1、TAP2 均有表达降低趋势，且Spearman相关性分析结果表明P16 与CD8 的表达呈负相关。因此，在喉鳞状细胞癌中，HPV感染后抑制癌细胞TAP的表达，降低HLA分子抗原提呈过程，从而抑制CD8+T细胞数量，但本研究中样本量有限，有关P16 和TAP 表达的相关性及具体的免疫调控机制有待于进一步试验证实。

影响喉癌患者预后的因素诸多，Cavalieri 等［30］研究表明年龄、TNM 分期是喉鳞状细胞癌预后的独立危险因素。Zhu 等［31］研究表明，低分化LSCC 患者的预后明显低于高分化和中分化LSCC患者，因此，组织病理学的差异是LSCC的一个重要预后因素。相关研究表明，P16的表达是喉鳞状细胞癌患者长期总生存期和疾病特异性生存期的独立危险因素，头颈部鳞癌转移灶中HLA 和TAP 的下调是预后不良的标志，头颈部鳞癌肿瘤微环境中CD8+T 细胞的衰竭决定了预后不良［32-34］。本研究结果显示，肿瘤长径、脉管侵犯、淋巴结转移与患者预后相关；Cox 回归模型分析显示脉管侵犯、淋巴结转移是喉鳞状细胞癌预后的独立危险因素，而P16、TAP、HLA 和CD8 的表达与喉癌预后的不相关，可能与本研究组样本量少有关。

综上所述，喉鳞状细胞癌中存在HPV感染，但由于受样本量限制，本研究结果未发现HPV 感染与临床病理因素及预后之间的相关性。通过检测TAP、HLA 及CD8的表达，显示喉鳞状细胞癌组织中TAP 及HLA 表达下调，从而抑制HLA 抗原提呈功能，降低肿瘤内CD8+T 细胞数量，抑制机体的免疫应答，促使肿瘤细胞逃避免疫监视。虽然本研究结果显示TAP 的表达与HPV 感染无相关性，可能是本研究中采用的临床样本量较少，不足以说明HPV 感染状态与TAP之间的关系，有待于扩大样本量后进一步证实。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明李逸群：研究设计与实施、数据采集与分析、撰写文章、统计分析；易丽君、李云荣、安姝憬：研究实施；陈庆勇：研究设计与指导；李红：研究设计、对文章的知识性内容作批评性审阅、指导